Den nuværende protokol forklarer dannelsen af et 2D-monolag af cerebellære celler fra inducerede pluripotente stamceller til undersøgelse af de tidlige stadier af cerebellær udvikling.
Den præcise og rettidige udvikling af lillehjernen er afgørende ikke kun for nøjagtig motorkoordinering og balance, men også for kognition. Derudover har forstyrrelser i cerebellar udvikling været impliceret i mange neurodevelopmental lidelser, herunder autisme, opmærksomhedsunderskud-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) og skizofreni. Undersøgelser af cerebellær udvikling hos mennesker har tidligere kun været mulige gennem post mortem-undersøgelser eller neuroimaging, men disse metoder er ikke tilstrækkelige til at forstå de molekylære og cellulære ændringer, der forekommer in vivo under tidlig udvikling, hvilket er når mange neuroudviklingsforstyrrelser stammer fra. Fremkomsten af teknikker til at generere menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC’er) fra somatiske celler og evnen til yderligere at differentiere iPSC’er til neuroner har banet vejen for in vitro-modellering af tidlig hjerneudvikling. Denne undersøgelse giver forenklede trin i retning af at generere cerebellære celler til applikationer, der kræver en 2-dimensionel (2D) monolagsstruktur. Cerebellarceller, der repræsenterer tidlige udviklingsstadier, stammer fra humane iPSC’er via følgende trin: først fremstilles embryoidlegemer i 3-dimensionel (3D) kultur, derefter behandles de med FGF2 og insulin for at fremme cerebellar skæbnespecifikation, og endelig differentieres de terminalt som et monolag på poly-l-ornithin (PLO) / lamininbelagte substrater. Ved 35 dages differentiering udtrykker iPSC-afledte cerebellære cellekulturer cerebellære markører, herunder ATOH1, PTF1α, PAX6 og KIRREL2, hvilket tyder på, at denne protokol genererer glutamatergiske og GABAergiske cerebellære neuronale forstadier samt Purkinje-celleforfædre. Desuden viser de differentierede celler tydelig neuronal morfologi og er positive for immunfluorescensmarkører for neuronal identitet såsom TUBB3. Disse celler udtrykker aksonale vejledningsmolekyler, herunder semaphorin-4C, plexin-B2 og neuropilin-1, og kan tjene som en model til undersøgelse af de molekylære mekanismer for neuritudvækst og synaptisk forbindelse. Denne metode genererer humane cerebellære neuroner, der er nyttige til downstream-applikationer, herunder genekspression, fysiologiske og morfologiske undersøgelser, der kræver 2D-monolagsformater.
At forstå menneskelig cerebellær udvikling og de kritiske tidsvinduer i denne proces er vigtig ikke kun for at afkode de mulige årsager til neuroudviklingsforstyrrelser, men også for at identificere nye mål for terapeutisk intervention. Modellering af menneskelig cerebellær udvikling in vitro har været udfordrende, men over tid er der opstået mange protokoller, der differentierer menneskelige embryonale stamceller (hESC’er) eller iPSC’er med cerebellære afstamningsskæbner 1,2,3,4,5,6,7,8 . Desuden er det vigtigt at udvikle protokoller, der genererer reproducerbare resultater, er relativt enkle (for at reducere fejl) og ikke er tunge på monetære omkostninger.
De første protokoller for cerebellær differentiering blev genereret fra 2D-kulturer fra belagte embryoidlegemer (EB’er), hvilket inducerede cerebellær skæbne med forskellige vækstfaktorer svarende til in vivo-udvikling, herunder WNT, BMP’er og FGF’er 1,9. Nyere offentliggjorte protokoller inducerede differentiering primært i 3D-organoidkultur med FGF2 og insulin, efterfulgt af FGF19 og SDF1 til rhombiske læbelignende strukturer 3,4 eller anvendte en kombination af FGF2, FGF4 og FGF85. Begge cerebellære organoide induktionsmetoder resulterede i lignende 3D cerebellar organoider, da begge protokoller rapporterede lignende cerebellære markørekspression på identiske tidspunkter. Holmes og Heine udvidede deres 3D-protokol5 for at vise, at 2D cerebellære celler kan genereres fra hESC’er og iPSC’er, der starter som 3D-aggregater. Derudover viste Silva et al.7, at celler, der repræsenterer modne cerebellære neuroner i 2D, kan genereres med en lignende tilgang til Holmes og Heine ved hjælp af et andet tidspunkt for at skifte fra 3D til 2D og forlænge vækst- og modningstiden.
Den nuværende protokol inducerer cerebellær skæbne i feederfrie iPSC’er ved at generere fritsvævende embryoidlegemer (EB’er) ved hjælp af insulin og FGF2 og derefter plettere EB’erne på PLO / lamininbelagte retter på dag 14 til 2D-vækst og differentiering. På dag 35 opnås celler med cerebellær identitet. Evnen til at rekapitulere de tidlige stadier af cerebellær udvikling, især i et 2D-miljø, gør det muligt for forskere at besvare specifikke spørgsmål, der kræver eksperimenter med en monolagsstruktur. Denne protokol er også modtagelig for yderligere modifikationer såsom mikropatternede overflader, aksonale udvækstassays og cellesortering for at berige de ønskede cellepopulationer.
Evnen til at modellere menneskelig cerebellær udvikling in vitro er vigtig for sygdomsmodellering samt fremme forståelsen af normal hjerneudvikling. Mindre komplicerede og omkostningseffektive protokoller skaber flere muligheder for replikerbar datagenerering og bred implementering på tværs af flere videnskabelige laboratorier. En cerebellar differentieringsprotokol er beskrevet her ved hjælp af en modificeret metode til generering af EB’er, der ikke kræver enzymer eller dissociationsmidler, ved hjælp af …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jenny Gringer Richards for hendes grundige arbejde med at validere vores kontrolemner, hvorfra vi genererede kontrol-iPSC’erne. Dette arbejde blev støttet af NIH T32 MH019113 (til D.A.M. og K.A.K.), Nellie Ball Trust (til T.H.W. og A.J.W.), NIH R01 MH111578 (til V.A.M. og J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (til A.J.W.) og Roy J. Carver Charitable Trust (til V.A.M., J.A.W. og A.J.W.). Figurerne blev skabt med BioRender.com.
10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
Emricasan | Cayman | 22204 | |
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
IMDM | Gibco | 12440053 | |
Insulin | Gibco | 12585 | |
Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
SB431542 | Sigma | 54317 | |
See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
Y-27632 | Biogems | 1293823 |