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환경과학

代謝産物生産に対するフタル酸ジ(2-エチルヘキシル)の影響を研究するためのアルファルファ根滲出液の収集

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64470
, , ,
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences

Summary

根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。

Abstract

根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.

Introduction

フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重大な懸念が提起されてきました。

植物は通常、DEHP曝露に対して脆弱です。DEHPストレスは、種子の発芽と正常な代謝に悪影響を及ぼし、それによって植物の成長と発達を阻害することが観察されています8,9。例えば、DEHPは葉肉細胞に酸化的損傷を誘発し、クロロフィルおよび浸透圧の含有量を減少させ、抗酸化酵素活性を上昇させ、最終的には食用植物の収量および品質を低下させる可能性がある10,11。しかし、DEHPストレスに対する植物の応答に関する以前の研究のほとんどは、酸化ストレスと生理学的および生化学的特性に焦点を当ててきました。植物の代謝に関連する対応するメカニズムはあまり研究されていません。根の滲出液は、植物の根が分泌し、環境に放出する化合物を表す総称です。それらは植物と根圏土壌の間の相互作用媒体と考えられており、植物の成長と発達をサポートする上で重要な役割を果たしています12。根の滲出液がすべての光合成炭素13の約30%〜40%を占めることはよく知られています。汚染された環境では、根の滲出液は、代謝または外部排除を通じて汚染物質のストレスに対する植物の耐性を改善することに関与しています14。結果として、汚染ストレスに対する植物の根の滲出液の応答を深く理解することは、細胞の生化学および生物学的現象に関連する根本的なメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります15。

メタボロミクス技術は、細胞16、17、組織18、さらには糖、有機酸、アミノ酸、脂質を含む生物19の滲出液内の多数の低分子代謝物を同時に測定するための効率的な戦略を提供します。従来または従来の化学分析法と比較して、メタボロミクスアプローチは検出可能な代謝物の数を大幅に増加させ20、これはより高いスループットの方法で代謝物を同定し、主要な代謝経路を特定するのに役立ちます。メタボロミクスは、重金属21、新興汚染物質22、ナノ粒子19などのストレス環境における生物学的応答の研究分野で広く使用されています。植物に関するこれらの研究のほとんどは、植物内部の代謝変化に焦点を当てていますが、環境ストレスに対する根の滲出液の反応について報告されたものはほとんどありません。したがって、この研究の目的は、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入することです 代謝産物産生に対するDEHPの影響を研究します。この結果は、DEHPによる植物メタボロミクスの追跡調査のためのメソッドガイダンスを提供します。

Protocol

このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。 1. 水耕栽培実験 注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルフ?…

Representative Results

この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。 コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。 <s…

Discussion

このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。

Materials

Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).
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