Collecte d’exsudats de racines de luzerne pour étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) sur la production de métabolites

Summary

La sécrétion d’exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole décrit comment évaluer l’impact des xénobiotiques sur la luzerne par analyse métabolomique non ciblée.

Abstract

Les exsudats racinaires sont les principaux moyens de communication de l’information et de transfert d’énergie entre les racines des plantes et le milieu environnant. Le changement dans la sécrétion des exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole vise à introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) sur la production de métabolites. Tout d’abord, les semis de luzerne sont cultivés sous stress DEHP dans une expérience de culture hydroponique. Deuxièmement, les plantes sont transférées dans des tubes de centrifugation contenant 50 mL d’eau ultrapure stérilisée pendant 6 h pour recueillir les exsudats racinaires. Les solutions sont ensuite lyophilisées dans un lyophilisateur sous vide. Les échantillons congelés sont extraits et dérivatisés avec le réactif bis(triméthylsilyl)) trifluoroacétamide (BSTFA). Par la suite, les extraits dérivatisés sont mesurés à l’aide d’un système de chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à temps de vol (GC-TOF-MS). Les données sur les métabolites acquis sont ensuite analysées selon des méthodes bioinformatiques. Les métabolites différentiels et les voies métaboliques significativement modifiées devraient être explorés en profondeur pour révéler l’impact du DEHP sur la luzerne compte tenu des exsudats racinaires.

Introduction

Le phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) est un composé chimique synthétique largement utilisé dans divers plastiques et polymères comme plastifiant pour améliorer leur plasticité et leur résistance. Au cours des dernières années, un nombre croissant d’études ont suggéré que le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets néfastes sur les systèmes respiratoire, nerveux et reproducteur des humains et des autres animaux ^1,2,3. Compte tenu de son risque pour la santé, l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, l’Union européenne et le Centre de surveillance environnementale de Chine ont tous classé le DEHP dans la liste des polluants prioritaires. Le sol a été considéré comme un puits important de DEHP dans l’environnement, en raison de l’application de paillage plastique et d’engrais organiques, de l’irrigation avec des eaux usées et de l’application de boues^{agricoles 4}. Comme prévu, le DEHP a été détecté de manière omniprésente dans les sols des terres agricoles, dont la teneur atteint même jusqu’à milligrammes par kilogramme de sol séché dans certaines régions de Chine ^5,6. Le DEHP peut pénétrer dans les plantes principalement par les racines et subir une bioamplification à différents niveaux trophiques dans les écosystèmes du sol⁷. Par conséquent, au cours des dernières décennies, des préoccupations importantes ont été soulevées au sujet du stress induit par le DEHP dans les usines.

Les plantes sont généralement vulnérables à l’exposition au DEHP. Il a été observé que le stress du DEHP exerce un effet néfaste sur la germination des graines et le métabolisme normal, inhibant ainsi la croissance et le développement des plantes ^8,9. Par exemple, le DEHP peut induire des dommages oxydatifs aux cellules mésophylles, diminuer la teneur en chlorophylle et en osmolytes, et élever les activités enzymatiques antioxydantes, entraînant éventuellement une baisse du rendement et de la qualité des plantes comestibles^10,11. Cependant, la plupart des études antérieures sur la réponse des plantes au stress du DEHP se sont concentrées sur le stress oxydatif et les caractéristiques physiologiques et biochimiques. Les mécanismes correspondants associés au métabolisme des plantes sont moins étudiés. Les exsudats racinaires sont un terme générique décrivant les composés que les racines des plantes sécrètent et libèrent dans l’environnement. Ils ont été considérés comme les milieux d’interaction entre les plantes et le sol de la rhizosphère, jouant un rôle important dans le soutien de la croissance et du développement^{des plantes 12}. Il est bien connu que les exsudats racinaires représentent environ 30% à 40% de tout le carbone photosynthétique¹³. Dans les milieux pollués, les exsudats racinaires sont impliqués dans l’amélioration de la tolérance des plantes au stress des polluants par métabolisme ou exclusion externe¹⁴. En conséquence, une compréhension approfondie de la réponse des exsudats racinaires des plantes au stress de pollution peut aider à révéler les mécanismes sous-jacents associés à la biochimie cellulaire et aux phénomènes biologiques¹⁵.

La technologie métabolomique fournit une stratégie efficace pour mesurer un grand nombre de métabolites de petites molécules simultanément dans les cellules 16,17, les tissus¹⁸, et même les exsudats d’organismes ¹⁹, y compris les sucres, les acides organiques, les acides aminés et les lipides. Par rapport aux méthodes d’analyse chimique traditionnelles ou classiques, l’approche métabolomique augmente considérablement le nombre de métabolites pouvant être détectés²⁰, ce qui peut aider à identifier les métabolites de manière plus débitée et à identifier les voies métaboliques clés. La métabolomique a été largement utilisée dans le domaine de la recherche sur la réponse biologique dans les environnements de stress, tels que les métaux lourds²¹, les polluants émergents²² et les nanoparticules¹⁹. La plupart de ces études sur les plantes se sont concentrées sur les changements métaboliques dans les tissus végétaux intérieurs, alors que peu ont été rapportées sur la réponse des exsudats racinaires au stress environnemental. Par conséquent, le but de cette étude est d’introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du DEHP sur la production de métabolites. Les résultats fourniront une orientation méthodologique pour l’étude de suivi de la métabolomique végétale par le DEHP.

Protocol

L’objectif de ce protocole est de fournir un pipeline général, d’une expérience de culture hydroponique à l’analyse métabolomique, quantifiant l’effet du DEHP sur les exsudats de racines de luzerne. 1. Expérience de culture hydroponique REMARQUE : Ce protocole présente un exemple d’expérience de culture hydroponique de luzerne conçue pour obtenir des semis de luzerne (Medicago sativa) sous le stress de différentes concentr…

Representative Results

Dans cette expérience, des exsudats de racines de luzerne ont été recueillis, extraits et analysés selon les méthodes ci-dessus (figure 1). Trois groupes de traitement ont été mis en place : témoin, faible concentration de DEHP (1 mg L-1) et concentration élevée de DEHP (10 mg L-1). Au total, 778 pics ont été détectés dans le chromatographe du témoin, dont 314 métabolites ont pu être identifiés en fonction des spectres de ma…

Discussion

Ce protocole fournit des conseils généraux sur la façon de recueillir et de mesurer les exsudats racinaires de luzerne sous stress DEHP, ainsi que sur la façon d’analyser les données du métabolome. Une attention particulière doit être accordée à certaines étapes critiques de ce protocole. Dans les expériences de culture hydroponique, les semis de luzerne ont été cultivés hydroponiquement dans des bouteilles en verre remplies de solutions nutritives avec différentes concentrations de DEHP. Les bouteilles…

Materials

Adonitol	SIGMA		≥99%
Alfalfa seeds	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, v/v
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
Chromatographic column	Agilent	DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC)	Agilent	7890A
Grinding instrument	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS)	LECO	PEGASUS HT
Methanol	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
Microcentrifuge tube	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
Pyridine	Adamas		HPLC
R software			statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2			statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 series
Ultrasound	Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
Vacuum dryer	Taicang Huamei biochemical instrument factory	LNG-T98