Sammlung von Alfalfa-Wurzelexsudaten zur Untersuchung des Einflusses von Di(2-ethylhexyl)phthalat auf die Metabolitenproduktion

Summary

Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.

Abstract

Wurzelexsudate sind die wichtigsten Medien der Informationskommunikation und des Energietransfers zwischen Pflanzenwurzeln und der Umgebung. Die Veränderung der Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien für die Sammlung von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um die Auswirkungen von Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Zunächst werden Luzerne-Sämlinge unter DEHP-Stress in einem hydroponischen Kulturexperiment gezüchtet. Zweitens werden die Pflanzen für 6 h in Zentrifugenröhrchen mit 50 ml sterilisiertem Reinstwasser überführt, um Wurzelexsudate zu sammeln. Anschließend werden die Lösungen in einem Vakuum-Gefriertrockner gefriergetrocknet. Die gefrorenen Proben werden extrahiert und mit Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz derivatisiert. Anschließend werden die derivatisierten Extrakte mit einem Gaschromatographensystem in Verbindung mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gemessen. Die gewonnenen Metabolitendaten werden dann mit bioinformatischen Methoden analysiert. Differentielle Metaboliten und signifikant veränderte Stoffwechselwege sollten eingehend erforscht werden, um die Auswirkungen von DEHP auf Luzerne im Hinblick auf Wurzelexsudate aufzudecken.

Introduction

Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) ist eine synthetische chemische Verbindung, die in verschiedenen Kunststoffen und Polymeren als Weichmacher verwendet wird, um deren Plastizität und Festigkeit zu verbessern. In den letzten Jahren deuten immer mehr Studien darauf hin, dass DEHP ein endokriner Disruptor ist und sich nachteilig auf die Atemwege, Nerven und Fortpflanzungssysteme von Menschen und anderen Tieren auswirkt ^1,2,3. In Anbetracht seines Gesundheitsrisikos haben die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten, die Europäische Union und das Environmental Monitoring Center of China DEHP in die Liste der prioritären Schadstoffe aufgenommen. Der Boden wurde aufgrund der Anwendung von Kunststoffmulch und organischem Dünger, der Bewässerung mit Abwasser und der Anwendung von Schlammfarmen als wichtige Senke von DEHP in der Umwelt angesehen⁴. Erwartungsgemäß wurde DEHP ubiquitär in landwirtschaftlich genutzten Böden nachgewiesen, deren Gehalt in einigen Regionen Chinas sogar bis zu Milligramm pro Kilogramm getrockneter Böden erreicht ^5,6. DEHP kann hauptsächlich über die Wurzeln in Pflanzen eindringen und auf verschiedenen trophischen Ebenen in Bodenökosystemen biomagnifikiert werden⁷. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten erhebliche Besorgnis über DEHP-induzierten Stress in Pflanzen geäußert.

Pflanzen sind in der Regel anfällig für eine DEHP-Exposition. Es wurde beobachtet, dass DEHP-Stress eine nachteilige Wirkung auf die Samenkeimung und den normalen Stoffwechsel ausübt und dadurch das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen hemmt ^8,9. Zum Beispiel kann DEHP oxidative Schäden an Mesophyllzellen induzieren, den Gehalt an Chlorophyll und Osmolyten verringern und die antioxidative Enzymaktivität erhöhen, was schließlich zu einer Abnahme des Ertrags und der Qualität essbarer Pflanzen führt^10,11. Die meisten bisherigen Studien über die Reaktion von Pflanzen auf DEHP-Stress konzentrierten sich jedoch auf oxidativen Stress und physiologische und biochemische Eigenschaften. Die entsprechenden Mechanismen, die mit dem pflanzlichen Stoffwechsel verbunden sind, sind weniger erforscht. Wurzelexsudate ist ein Oberbegriff, der Verbindungen beschreibt, die Pflanzenwurzeln absondern und in die Umwelt abgeben. Sie gelten als Interaktionsmedien zwischen Pflanzen und dem Boden der Rhizosphäre und spielen eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung¹². Es ist bekannt, dass Wurzelexsudate etwa 30%-40% des gesamten photosynthetischen^{Kohlenstoffs ausmachen 13}. In verschmutzten Umgebungen sind Wurzelausscheidungen an der Verbesserung der Toleranz von Pflanzen gegenüber dem Stress von Schadstoffen durch Stoffwechsel oder äußeren Ausschluss beteiligt¹⁴. Folglich könnte ein tiefes Verständnis der Reaktion von Pflanzenwurzelexsudaten auf Verschmutzungsstress dazu beitragen, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die mit der Zellbiochemie und biologischen Phänomenen verbunden sind¹⁵.

Die Metabolomik-Technologie bietet eine effiziente Strategie zur gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von niedermolekularen Metaboliten in Zellen 16,17, Geweben¹⁸ und sogar Exsudaten von Organismen ¹⁹, einschließlich Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren und Lipiden. Im Vergleich zu herkömmlichen oder klassischen chemischen Analysemethoden erhöht der Metabolomik-Ansatz die Anzahl der nachweisbaren Metaboliten erheblich²⁰, was dazu beitragen kann, Metaboliten mit höherem Durchsatz zu identifizieren und wichtige Stoffwechselwege zu identifizieren. Die Metabolomik ist im Forschungsbereich der biologischen Reaktion in Stressumgebungen, wie z. B. Schwermetalle²¹, neu auftretende Schadstoffe²² und Nanopartikel¹⁹, weit verbreitet. Die meisten dieser Studien an Pflanzen konzentrierten sich auf die metabolischen Veränderungen im inneren Pflanzengewebe, während nur wenige über die Reaktion von Wurzelexsudaten auf Umweltstress berichtet wurden. Ziel dieser Studie ist es daher, allgemeine Richtlinien für die Entnahme von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um den Einfluss von DEHP auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dienen als methodischer Leitfaden für die Folgestudie der pflanzlichen Metabolomik mittels DEHP.

Protocol

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von einem hydroponischen Kulturexperiment bis hin zu metabolomischen Analysen bereitzustellen, um die Wirkung von DEHP auf Luzernewurzelexsudate zu quantifizieren. 1. Hydroponisches Kulturexperiment HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel für ein hydroponisches Luzerne-Kulturexperiment, das entwickelt wurde, um Luzerne-Sämlinge (Medicago sativa) unter dem Stress verschiedener …

Representative Results

In diesem Experiment wurden Luzernewurzelexsudate gesammelt, extrahiert und nach den oben genannten Methoden analysiert (Abbildung 1). Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet: Kontrollgruppe, niedrige Konzentration von DEHP (1 mg L−1) und hohe Konzentration von DEHP (10 mg L−1). Im Chromatographen der Kontrollgruppe wurden insgesamt 778 Peaks detektiert, von denen 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert werden konnt…

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine allgemeine Anleitung zur Erfassung und Messung der Wurzelexsudate von Luzerne unter DEHP-Stress sowie zur Analyse der Metabolomdaten. Einigen kritischen Schritten in diesem Protokoll muss besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. In hydroponischen Kulturexperimenten wurden Luzerne-Sämlinge hydroponisch in Glasflaschen kultiviert, die mit Nährlösungen mit unterschiedlichen DEHP-Konzentrationen gefüllt waren. Die Glasflaschen sollten während der gesamten Kulturperiode vor Licht geschützt…

Materials

Adonitol	SIGMA		≥99%
Alfalfa seeds	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, v/v
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
Chromatographic column	Agilent	DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC)	Agilent	7890A
Grinding instrument	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS)	LECO	PEGASUS HT
Methanol	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
Microcentrifuge tube	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
Pyridine	Adamas		HPLC
R software			statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2			statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 series
Ultrasound	Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
Vacuum dryer	Taicang Huamei biochemical instrument factory	LNG-T98