En protokoll presenteres for bestemmelse av biomarkører med lav forekomst fra tørkede serumprøver eksemplifisert med biomarkøren progastrinfrigjørende peptid (ProGRP). Antistoffbelagte magnetiske perler brukes til selektiv opprydding og anrikning av et proteotypisk ProGRP-peptid. Det fangede peptidet analyseres deretter ved væskekromatografi-tandemmassespektrometri.
Denne artikkelen presenterer en protokoll med detaljerte beskrivelser for effektiv prøveopprydding av proteiner med lav overflod fra tørkede prøver. Dette utføres ved hjelp av perlebasert proteolyse før proteotypisk peptidaffinitetsfangst og væskekromatografitandemmassespektrometri (LC-MS/MS) bestemmelse. Prosedyren kan brukes på både konvensjonelle tørkede prøver ved bruk av papirkort (f.eks. tørkede blodflekker [DBS] og tørkede serumflekker [DSS]), samt prøver samlet med nyere prøvetakingsmetoder som volumetrisk absorberende mikroprøvetaking (VAMS). I tillegg til å beskrive denne prosedyren, presenteres fremstillingen av både trypsinperler og antistoffbelagte perler på en trinnvis måte i dette arbeidet. Fordelene ved den presenterte prosedyren er tidseffektiv proteolyse ved bruk av perler og selektiv robust opprydding ved bruk av peptidaffinitetsfangst. Den nåværende prosedyren beskriver bestemmelsen av den lav-overflod småcellet lungekreft (SCLC) biomarkør, progastrinfrigjørende peptid (ProGRP), i tørket serum (både DSS og VAMS). Detaljerte prosedyrer for preparasjon av perler gjør det enklere å implementere arbeidsflyten i nye applikasjoner eller andre laboratorier. Det er påvist at resultatene kan være avhengig av prøvetakingsmaterialet; For dette prosjektet ble det sett høyere signalintensiteter for prøver samlet inn ved hjelp av VAMS sammenlignet med DSS.
Mikrosampling har eksistert i mer enn 100 år siden Ivar Bang beskrev glukosemåling fra DBS i 19131. Etter at Guthrie og Susi introduserte DBS i 1963 for bestemmelse av fenylalanin hos nyfødte2, har teknikken blitt stadig mer utbredt. De første rapportene om DBS for prøvetaking og lagring av proteiner ble gjort tidlig på 1970-tallet3,4, og et tiår senere, på 1980-tallet, fant vi den første rapporten om massespektrometri (MS) for bestemmelse av proteiner fra DBS5. Til tross for denne tidlige introduksjonen var det først etter århundreskiftet at MS-bestemmelse av proteiner fra DBS og andre mikrosamplingsteknikker ble mer utbredt.
I klinisk sammenheng er det av interesse å påvise proteiner i diagnostikk og oppfølging av sykdommer, samt for behandlingsovervåking og dopingformål. Denne målrettede bestemmelsen av proteinanalytter ved MS fra små mengder tørkede prøver er fortsatt utfordrende, og krever ofte omfattende prøvepreparering før analyse.
Målrettet kvantitativ bestemmelse av proteiner ved MS utføres vanligvis ved å anvende bottom-up-tilnærmingen, fordøye proteinene til peptider før analyse. Denne prosedyren produserer et myriade av peptider, noe som gjør direkte analyse av den fordøyede biologiske prøven utfordrende. En måte å omgå dette på er å bruke et selektivt affinitetsoppryddingstrinn på forhånd av MS-analyse enten før eller etter fordøyelsen 6,7,8. På denne måten isoleres proteinet av interesse (eller dets proteotypiske peptid, hvis affinitetsfangsttrinnet utføres etter fordøyelsen) selektivt fra prøvematrisen før analyse, noe som gir lavere deteksjonsgrenser9.
Mikrosampling ved hjelp av DBS-kort har visse fordeler sammenlignet med konvensjonelle blodprøver, inkludert lavt prøvevolum, mindre invasiv prøvetaking og økt lagringsstabilitet. Prøvematrisen er imidlertid forskjellig og kan introdusere andre utfordringer i analysen (f.eks. tørket vs. væskeprøvematrise og kapillærblod vs. serum eller plasma)10,11. En annen utfordring som observeres med DBS er den såkalte hematokriteffekten, der blodhematokriten påvirker prøvevolumet som videre behandles for analyse, og dermed introduserer interindividuell variasjon i analysen12. Nyere mikroprøvetakingsenheter, som VAMS introdusert i 201413, løser dette problemet ved å samle et fast volum blod i stedet for en bloddråpe.
Denne protokollen beskriver et oppsett for analyse av biomarkører med lav overflod fra tørkede mikroprøver. Etter eluering fordøyes den tørkede prøven, og deretter isoleres det proteotypiske peptidet ved peptidaffinitetsfangst. Modellanalytten er SCLC-biomarkøren ProGRP. Siden ProGRP ikke kan bestemmes pålitelig fra fullblod, ble serum brukt som prøvematrise. Representative resultater fra både DSS og serumprøver tatt med VAMS er vist.
Den beskrevne protokollen inneholder informasjon om hvordan man utfører flere viktige trinn i analysen av biomarkører med lav overflod fra tørkede mikroprøver (DSS og VAMS), inkludert fremstilling av trypsinperler og antistoffbelagte magnetiske perler. Basert på tidligere erfaring behandler vi alltid antistoffet med syre før perlimmobilisering for å forbedre orienteringen av antistoffene15.
Et av de kritiske trinnene i denne prosedyren er valget av det mest passende mikrosamplingsformatet. Først må man vurdere om den aktuelle analytten kan bestemmes fra fullblod, eller om konsentrasjonen påvirkes av blodcellene og må bestemmes i serum eller plasma (som for modellanalytten, ProGRP).
Både papir- og polymerbaserte tilnærminger har fordeler og begrensninger; For ProGRP gir VAMS en klar fordel med hensyn til analyttgjenvinning etter ekstraksjon fra prøvetakeren. Dette kan imidlertid sannsynligvis optimaliseres ved hjelp av en annen ekstraksjonsløsning for DSS-prøvene. Dette potensielle samspillet mellom analytten og prøvetakingsmaterialet er likevel viktig å ta hensyn til, da det kan føre til økt analytisk variasjon og høyere deteksjonsgrenser. Siden IS brukes er et SIL-peptid og først tilsettes etter fordøyelsen, korrigerer IS for trinnene etter fordøyelsen (f.eks. affinitetsekstraksjon og LC-MS/MS-analyse). IS-korreksjon er ikke mulig for ekstraksjon fra DSS/VAMS og fordøyelsestrinnet.
To typer perler brukes i prosedyren: trypsinperler for fordøyelsen etter ekstraksjon av serumprøven fra prøvetakeren, og antistoffbelagte magnetiske perler for fangst av det proteotypiske peptidet etter fordøyelsen. En viktig grunn til å bruke trypsinperler, i tillegg til å øke fordøyelsen, er å minimere gjenværende trypsinaktivitet i prøven under affinitetsfangst. Dette er viktig for å unngå tryptisk proteolyse av mAb under affinitetsfangst.
Agaroseperler ble brukt til fremstilling av trypsinperlene, mens magnetiske perler ble brukt til fremstilling av antistoffbelagte perler. Agaroseperler er rimeligere enn magnetiske perler, men har en begrensning om at separasjon av perlene fra løsningen krever sentrifugering. Dette gjør separasjonen av perler og supernatant mindre effektiv enn ved bruk av magnetiske perler. I tillegg er automatisering av arbeidsflyten vanskelig ved bruk av agaroseperler. Imidlertid er magnetiske NHS-aktiverte perler tilgjengelige og kan brukes til en mer strømlinjeformet og automatisert arbeidsflyt for prøvepreparering.
Mikrosampling er en viktig trend i bioanalysen av både legemidler og biomarkører. En utfordring med dagens tilnærming er den begrensede mengden prøvevolum (10 μL), noe som kan være spesielt viktig ved bestemmelse av svært lav mengdeanalytter som ProGRP (pg/ml-lavt ng/ml-nivå). Denne utfordringen kan imidlertid omgås ved hjelp av toppmoderne analyseutstyr. For disse analyttene med lav overflod er valg av prøvepreparering avgjørende, og selektiv prøveopprydding gjennom antistoffbasert affinitetsfangst er oftest nødvendig. Siden peptidfangst har vist seg å gi renere ekstrakter og lavere deteksjonsgrenser enn proteinfangst (ved bruk av samme antistoff)14, fokuserer den nåværende metoden på denne tilnærmingen i kombinasjon med mikrosampling. En annen fordel med peptidfangstmetoden er at IS SIL-peptidet også korrigerer for affinitetsfangsttrinnet.
I dette arbeidet ble et antistoff rettet mot et protein brukt til peptidfangst. Dette er en fordel da tilgjengeligheten av hyllevare antistoffer rettet mot proteiner er høyere enn hyllevare antistoffer rettet mot proteotypiske peptider. For at et antiproteinantistoff effektivt skal fange et proteotypisk peptid, må imidlertid epitopen være intakt etter proteinfordøyelse. I tillegg, for mange antistoffer, er den eksakte epitopen ikke kjent, noe som gjør søket etter et anti-protein antistoff kjedelig. Dette begrenser antall tilgjengelige antiproteinantistoffer som gjelder for peptidfangst. Den beskrevne prosedyren er demonstrert ved bruk av serum som matrise og ProGRP som målanalytt. Prosedyren er ment å kunne brukes på andre matriser og andre målanalytter. I stedet for å bruke et kommersielt tilgjengelig antiproteinantistoff for affinitetsfangst av det proteotypiske peptidet, er det mulig å også bruke skreddersydde, anti-peptidantistoffer. Oppryddingseffektiviteten av peptidfangst sammenlignet med proteinfangst er illustrert i figur 5. Ved å bytte ut agaroseperlene som brukes til fremstilling av trypsinperler med magnetiske perler, bør prosedyren også være kompatibel med arbeidsstasjoner for robotprøvepreparering på markedet.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Prof. Elisabeth Paus ved Radiumhospitalet (Oslo universitetssykehus, Oslo, Norge) for å ha levert ProGRP-standarden og anti-ProGRP monoklonalt antistoff, M18. Publiseringsavgiften ble dekket av et stipend fra apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen og Léon Reubsaet er partnere i konsortiet National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), som er finansiert av Norges forskningsråds INFRASTRUKTUR-program (prosjektnummer: 295910).
Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |