Ett protokoll presenteras för bestämning av biomarkörer med låg förekomst från torkade serumprover exemplifierade med biomarkören progastrinfrisättande peptid (ProGRP). Antikroppsbelagda magnetiska pärlor används för selektiv rengöring och anrikning av en proteotypisk ProGRP-peptid. Den fångade peptiden analyseras därefter med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri.
Detta dokument presenterar ett protokoll med detaljerade beskrivningar för effektiv provrensning av proteiner med låg förekomst från torkade prover. Detta utförs med hjälp av pärlbaserad proteolys före proteotypisk peptidaffinitetsinfångning och vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) bestämning. Förfarandet kan tillämpas på både konventionella torkade prover med papperskort (t.ex. torkade blodfläckar [DBS] och torkade serumfläckar [DSS]), liksom prover som samlats in med nyare provtagningsmetoder såsom volymetrisk absorberande mikroprovtagning (VAMS). Förutom att beskriva denna procedur presenteras beredningen av både trypsinpärlor och antikroppsbelagda pärlor steg för steg i detta arbete. Fördelarna med den presenterade proceduren är tidseffektiv proteolys med pärlor och selektiv robust rengöring med peptidaffinitetsinfångning. Det nuvarande förfarandet beskriver bestämningen av biomarkören för småcellig lungcancer med låg förekomst (SCLC), progastrinfrisättande peptid (ProGRP), i torkat serum (både DSS och VAMS). Detaljerade procedurer för pärlberedning gör det lättare att implementera arbetsflödet i nya applikationer eller andra laboratorier. Det har visats att resultaten kan vara beroende av provtagningsmaterialet. För det aktuella projektet sågs högre signalintensiteter för prover som samlats in med VAMS jämfört med DSS.
Mikroprovtagning har funnits i mer än 100 år sedan Ivar Bang beskrev glukosövervakning från DBS 19131. Efter att Guthrie och Susi introducerade DBS 1963 för bestämning av fenylalanin hos nyfödda2 har tekniken blivit alltmer utbredd. De första rapporterna om DBS för provtagning och lagring av proteiner gjordes i början av 1970-talet3,4, och ett decennium senare, på 1980-talet, hittade vi den första rapporten om masspektrometri (MS) för bestämning av proteiner från DBS5. Trots denna tidiga introduktion var det inte förrän efter sekelskiftet som MS-bestämning av proteiner från DBS och andra mikroprovtagningstekniker blev mer utbredd.
I ett kliniskt sammanhang är det av intresse att bestämma proteiner vid diagnos och uppföljning av sjukdomar, samt för behandlingsövervakning och dopingändamål. Denna riktade bestämning av proteinanalyter av MS från små mängder torkade prover är fortfarande utmanande och kräver ofta omfattande provberedning före analys.
Riktad kvantitativ bestämning av proteiner genom MS utförs vanligen genom att tillämpa bottom-up-metoden, smälta proteinerna till peptider före analys. Denna procedur producerar en myriad av peptider, vilket gör direkt analys av det smälta biologiska provet utmanande. Ett sätt att kringgå detta är att tillämpa ett selektivt affinitetsrensningssteg före MS-analys antingen före eller efter matsmältningen 6,7,8. På detta sätt isoleras proteinet av intresse (eller dess proteotypiska peptid, om affinitetsinfångningssteget utförs efter matsmältningen) selektivt från provmatrisen före analys, vilket ger lägre detektionsgränser9.
Mikroprovtagning med DBS-kort har vissa fördelar jämfört med konventionella blodprover, inklusive låg provvolym, mindre invasiv provtagning och ökad lagringsstabilitet. Provmatrisen är dock annorlunda och kan introducera andra utmaningar i analysen (t.ex. torkad kontra flytande provmatris och kapillärblod kontra serum eller plasma)10,11. En annan utmaning som observeras med DBS är den så kallade hematokriteffekten, där blodhematokriten påverkar provvolymen som bearbetas vidare för analys, och därmed introducerar interindividuell variabilitet i analysen12. Nyare mikroprovtagningsenheter, såsom VAMS som introducerades 201413, tar itu med detta problem genom att samla in en fast volym blod istället för en bloddroppe.
Detta protokoll beskriver en inställning för analys av biomarkörer med låg förekomst från torkade mikroprover. Efter eluering spjälkas det torkade provet och därefter isoleras den proteotypiska peptiden genom peptidaffinitetsinfångning. Modellanalyten är SCLC-biomarkören ProGRP. Eftersom ProGRP inte kan bestämmas på ett tillförlitligt sätt från helblod användes serum som provmatris. Representativa resultat från både DSS och serumprover som samlats in med VAMS visas.
Det beskrivna protokollet innehåller information om hur man utför flera viktiga steg i analysen av biomarkörer med låg överflöd från torkade mikroprover (DSS och VAMS), inklusive beredning av trypsinpärlor och antikroppsbelagda magnetiska pärlor. Baserat på tidigare erfarenhet behandlar vi alltid antikroppen med syra före pärlimmobilisering för att förbättra orienteringen av antikropparna15.
Ett av de kritiska stegen i denna procedur är valet av det lämpligaste mikroprovtagningsformatet. Först måste man överväga om analyten i fråga kan bestämmas från helblod, eller om koncentrationen påverkas av blodcellerna och måste bestämmas i serum eller plasma (som för modellanalyten, ProGRP).
Både pappers- och polymerbaserade metoder har fördelar och begränsningar; för ProGRP ger VAMS en klar fördel med avseende på analytåtervinning efter extraktion från provtagaren. Detta kan dock förmodligen optimeras med en annan extraktionslösning för DSS-proverna. Denna potentiella interaktion mellan analyten och provtagningsmaterialet är dock viktig att ta hänsyn till eftersom den kan leda till ökad analytisk variation och högre detektionsgränser. Eftersom IS som används är en SIL-peptid och först tillsätts efter matsmältningen, korrigerar IS för stegen efter matsmältningen (t.ex. affinitetsextraktion och LC-MS/MS-analys). IS-korrigering är inte möjlig för extraktion från DSS/VAMS och rötsteget.
Två typer av pärlor används i proceduren: trypsinpärlor för matsmältning efter extraktion av serumprovet från provtagaren och antikroppsbelagda magnetiska pärlor för infångning av den proteotypiska peptiden efter matsmältning. En viktig anledning till att använda trypsinpärlor, förutom att påskynda matsmältningen, är att minimera kvarvarande trypsinaktivitet i provet under affinitetsfångst. Detta är viktigt för att undvika tryptisk proteolys av mAb under affinitetsinfångning.
Agarospärlor användes för beredning av trypsinpärlorna, medan magnetiska pärlor användes för beredning av de antikroppsbelagda pärlorna. Agarospärlor är billigare än magnetiska pärlor men har en begränsning att separering av pärlorna från lösningen kräver centrifugering. Detta gör separationen av pärlor och supernatant mindre effektiv än vid användning av magnetiska pärlor. Dessutom är automatisering av arbetsflödet svårt med agarospärlor. Magnetiska NHS-aktiverade pärlor är dock tillgängliga och kan användas för ett mer strömlinjeformat och automatiserat arbetsflöde för provberedning.
Mikroprovtagning är en viktig trend i bioanalysen av både läkemedel och biomarkörer. En utmaning med det nuvarande tillvägagångssättet är den begränsade mängden provvolym (10 μL), som kan vara av särskild betydelse vid bestämning av analyter med mycket låg förekomst såsom ProGRP (pg / ml låg ng / ml-nivå). Denna utmaning kan dock kringgås med hjälp av toppmodern analysutrustning. För dessa analyter med låg förekomst är valet av provberedning avgörande, och selektiv provrensning genom antikroppsbaserad affinitetsfångst behövs oftast. Eftersom peptidinfångning har visat sig ge renare extrakt och lägre detektionsgränser än proteininfångning (med samma antikropp)14, fokuserar den nuvarande metoden på detta tillvägagångssätt i kombination med mikroprovtagning. En annan fördel med peptidinfångningsmetoden är att IS SIL-peptiden också korrigerar för affinitetsinfångningssteget.
I detta arbete användes en antikropp riktad mot ett protein för peptidinfångning. Detta är en fördel eftersom tillgången på off-the-shelf antikroppar riktade mot proteiner är högre än off-the-shelf antikroppar riktade mot proteotypiska peptider. Men för att en antiproteinantikropp effektivt ska fånga en proteotypisk peptid måste epitopen vara intakt efter proteinförtunning. Dessutom är den exakta epitopen för många antikroppar inte känd, vilket gör sökandet efter en antiproteinantikropp tråkig. Detta begränsar antalet tillgängliga antiproteinantikroppar som är tillämpliga för peptidinfångning. Den beskrivna proceduren demonstreras med serum som matris och ProGRP som målanalyt. Förfarandet är avsett att vara tillämpligt på andra matriser och andra målanalyter. Istället för att använda en kommersiellt tillgänglig antiproteinantikropp för affinitetsinfångning av den proteotypiska peptiden är det möjligt att också använda skräddarsydda antipeptidantikroppar. Rengöringseffektiviteten för peptidinfångning jämfört med proteininfångning illustreras i figur 5. Genom att byta ut agarospärlorna som används för framställning av trypsinpärlor mot magnetiska pärlor bör förfarandet också vara kompatibelt med arbetsstationer för robotprovberedning på marknaden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar professor Elisabeth Paus vid det norska Radiumsjukhuset (Oslo universitetssjukhus, Oslo, Norge) för att ha tillhandahållit ProGRP-standarden och den monoklonala antikroppen mot ProGRP, M18. Publiceringsavgiften täcktes av ett bidrag från Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen och Léon Reubsaet är partners i konsortiet National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), som finansieras av Norges forskningsråds INFRASTRUKTUR-program (projektnummer: 295910).
Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |