전층 연골 결손의 쥐 모델 개발 및 평가
Summary
이 프로토콜은 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫고 후속 통증 행동 및 조직병리학적 변화를 측정하여 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 설정합니다.
Abstract
외상으로 인한 무릎 관절의 연골 결손은 클리닉에서 흔히 볼 수 있는 스포츠 관절 손상이며, 이러한 결손은 관절 통증, 운동 장애, 그리고 결국 무릎 골관절염(kOA)을 초래합니다. 그러나 연골 결손이나 kOA에 대한 효과적인 치료법은 거의 없습니다. 동물 모델은 치료제 개발에 중요하지만 연골 결손에 대한 기존 모델은 만족스럽지 못하다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립하고 후속 통증 행동과 조직병리학적 변화를 판독 실험으로 사용했습니다. 수술 후, 기계적 금단 역치가 감소하고, 손상된 부위의 연골 세포가 손실되고, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP13 발현이 증가하고, II형 콜라겐 발현이 감소하여, 인간 연골 결함에서 관찰된 병리학적 변화와 일치한다. 이 방법론은 수행하기 쉽고 간단하며 부상 직후 육안적인 관찰이 가능합니다. 또한, 이 모델은 임상적 연골 결함을 성공적으로 모방할 수 있으므로 연골 결함의 병리학적 과정을 연구하고 해당 치료 약물을 개발하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
관절 연골은 연골 세포와 세포 외 기질1로 구성된 고도로 분화되고 조밀 한 조직입니다. 관절 연골의 표층은 유리질 연골의 한 형태로, 표면이 매끄럽고 마찰이 적으며 강도와 탄성이 좋으며 기계적 응력 내성이 우수합니다2. 세포외 기질은 콜라겐 프로테오글리칸과 물을 포함하며, 타입 II 콜라겐은 전체 콜라겐3의 약 90%를 차지하기 때문에 콜라겐의 주요 구조 성분이다. 연골 조직에는 혈관이나 신경이 존재하지 않기 때문에 손상 후 자가 복구 능력이 부족합니다4. 따라서 외상으로 인한 연골 결손은 항상 클리닉에서 다루기 힘든 관절 질환이었습니다. 또한, 이 관절 질환은 젊은이들을 공격하는 경향이 있으며 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있습니다 5,6. 무릎 관절은 연골 결손의 가장 흔한 부위이며, 여기서 결손은 관절 통증, 관절 기능 장애 및 관절 연골 변성을 동반하여 결국 무릎 골관절염(kOA)으로 이어집니다7. 무릎 관절의 연골 결손은 환자에게 경제적, 생리적 부담을 주고 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미친다8. 이 질병은 임박한 해결책이 없는 중대하고 시급한 임상적 문제를 제기합니다. 현재 수술은 연골 결손 치료의 중심이지만 장기적인 결과는 여전히 만족스럽지 않다9.
임상적 연골 결손은 결국 kOA를 유발하고, 따라서, kOA 동물 모델은 연골 결손의 병리학적 연구 및 약물 개발에 통상적으로 사용된다. 동물모델의 확립은 연골 결손 복구의 병태생리학적 과정을 이해하는 데 중요하며, 이는 연골 재생 및 섬유연골과 유리질 연골 사이의 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있다10. 그러나, 전방십자인대 절개술(ACLT), 내측 반월판의 불안정화(DMM), 난소절제술(OVX) 및 헐스(Hulth)와 같이 일반적으로 사용되는 kOA 동물 모델은 일반적으로 장기 모델링이 필요하고 병리학적 및 통증 평가만 허용하므로 약물 개발의 효율성에 한계가 있다11. 수술 모델 외에도 모노요오드아세테이트(monoiodoacetate, MIA) 및 파파인 주사와 같은 화학적 모델도 연골 결손을 초래하지만, 결손의 정도를 잘 관리할 수 없고, 임상 현실과는 거리가 멀다11. 충돌(Collision)은 큰 동물의 연골 결손을 모델링하는 또 다른 접근법이지만, 이 방법은 특정 기구의 사용에 따라 달라지며 거의 적용되지 않는다12.
요약하면, 기존의 kOA 모델은 연골 결손의 병인을 연구하거나 신약을 개발하는 데 이상적이지 않으며, 연골 결손의 특이적이고 표준화된 모델이 필요합니다. 이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 전층 연골 결손(FTCD) 모델을 확립했습니다. 모델 평가를 위해 육안 관찰, 통증 행동 테스트 및 조직병리학적 분석을 수행했습니다. kOA의 다른 동물 모델과 달리 이 모델은 쥐의 일반적인 상태에 거의 영향을 미치지 않습니다. 이 모델링 접근법은 접근 가능하고 잘 관리 할 수 있으며 연골 결함에서 kOA로의 진행에 대한 이해와 효과적인 치료법 개발을 지원합니다. 이 모델은 또한 골관절염 전 관절의 결함을 치유하여 kOA를 예방하는 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 쥐의 대퇴골 활차 홈에 구멍을 뚫어 임상적 연골 결함을 모방하는 동물 모델을 설명합니다(보충 그림 1). 연골 손상 후, 말초 통각 수용체의 흥분성 또는 반응성이 향상되고, 이는 통증 역치의 감소와 자극에 대한 반응성의 향상을 가져올 수 있다18. 전임상 연구에서, 다양한 동물 종의 연골 결함 모델링은 항상 통증을 유발했다19</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 절강 자연 과학 재단(보조금 번호 LQ20H270009), 중국 자연 과학 재단(보조금 번호 82074464 및 82104890), 절강 중국 전통 의학 재단(보조금 번호 2020ZA039, 2020ZA096 및 2022ZB137) 및 절강성 보건 위원회의 의료 보건 과학 및 기술 프로젝트(보조금 번호 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
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