Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi
Summary
Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.
Abstract
Antijene özgü antikorlar veya immün kontrol noktası inhibitörleri ile immünoterapi, meme kanseri tedavisinde devrim yaratmıştır. Epidermal büyüme faktörü reseptörü HER2’yi eksprese eden meme kanseri hücreleri, anti-HER-2 antikoru trastuzumab tarafından hedeflenebilir. Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC), HER-2’nin antitümör etkisinde rol oynayan önemli bir mekanizmadır. Kanser hücrelerine bağlı trastuzumab, ADCC efektör hücrelerinin (örneğin, doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar ve granülositler) Fc reseptörleri tarafından tanınabilir ve bu bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesini tetikleyerek kanser hücresi ölümüne yol açar. Yüksek içerikli tarama ile yeni ADCC modülatör bileşiklerini tanımlamak için ADCC’nin nicelleştirilmesi için görüntü tabanlı bir tahlil geliştirmek üzere yola çıktık. Tahlilde, JIMT-1 meme kanseri hücrelerini aşırı eksprese eden HER2, trastuzumab varlığında NK-92 hücreleri ile birlikte kültürlenir ve hedef hücre ölümü otomatik mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi ile ölçülür. Hedef hücreler, EGFP floresanlarına göre efektör hücrelerden ayırt edilir. ADCC modülatör ilaçlarını tanımlamak için bileşik kütüphanelerin tahlilde nasıl test edilebileceğini gösteriyoruz. Bu amaçla, laboratuvar rafından rastgele seçilmiş ince kimyasallar kullanılarak bir bileşik kütüphane test plakası kuruldu. NK hücre göçü ve degranülasyonuna müdahale etmesi beklenen üç mikrotübül destabilize edici bileşik (kolşisin, vinkristin, podofillotoksin) de test kütüphanesine dahil edildi. Test ekranı, üç pozitif kontrol bileşiğinin hepsini, kimyasal bir kütüphanede ADCC modifiye edici ilaçları tanımlamak için yöntemin uygunluğunu kanıtlayan isabetler olarak tanımladı. Bu tahlil ile, antikanser immünoterapileri alan hastaların tedavisinde adjuvan terapötik ajanlar olarak kullanılabilecek ADCC arttırıcı bileşikleri tanımlamak için bileşik kütüphane ekranları yapılabilir. Ek olarak, yöntem, kanser hastaları tarafından farklı endikasyonlar için alınan terapötik ilaçların istenmeyen ADCC inhibe edici yan etkilerini tanımlamak için de kullanılabilir.
Introduction
Antikanser antikorları, immün kontrol noktası inhibitörleri veya kimerik antijen reseptörü eksprese eden T (CAR-T) hücreleri ile immünoterapi, kanser tedavisine güçlü bir yaklaşımı temsil eder 1,2,3. Trastuzumab, HER-2 pozitif erken evre veya metastatik meme kanserinin yanı sıra HER-2 pozitif metastatik mide kanseri 4,5,6 tedavisinde kullanılan insanlaştırılmış bir monoklonal anti-HER-2 (insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2) antikorudur. Öncelikle epidermal büyüme faktörü4’ün proliferasyon uyarıcı etkisini inhibe ederek etki eder. Bununla birlikte, trastuzumab’ın, kanser hücreleri HER-2 stimülasyonuna 7 yanıtlarını kaybetmiş olsalar bile, kanser hücresi ölümünü etkili bir şekilde tetiklediği bildirilmiştir. Antikorun bu paradoksal etkisi, antikor bağımlı hücre aracılı sitotoksisiteye (ADCC)7 bağlıdır. ADCC, topluca ADCC 8,9’un efektör hücreleri olarak bilinen doğal öldürücü (NK) hücreler, granülositler ve makrofajlar tarafından aracılık edilebilir. Trastuzumab gibi bir antikor tümör hücrelerine bağlanırsa, bu efektör hücreler antikorun sabit (Fc) bölgesini bağlamak için Fc reseptörlerini kullanırlar. Antikor, tümör hücreleri ile Fc reseptörü taşıyan efektör hücreler arasında köprü kurarak sitotoksik mediatörlerinin salınımını tetikler10. Doğal öldürücü hücreler, hedef hücre zarında gözenekler oluşturmak için perforin içeren granüllerinin sitotoksik yükünü ve granzimi (hücre ölümü sinyal yollarını tetikleyen) kanser hücrelerinin apoptozuna yol açan immün sinapsa salgılarlar (bkz. Şekil 1).
Şekil 1: ADCC’de efektör ve hedef hücre etkileşimleri. Efektör NK hücresinin hücre yüzeyi Fcγ reseptörü, tümör hücresinin yüzeyinde eksprese edilen HER2 molekülüne özgü anti-HER2 trastuzumab antikorunun Fc bölgesini tanır. Böylece, iki hücre arasında immünolojik sinaps adı verilen ve efektör hücrenin sitotoksik granüllerinin yönlendirilmiş ekzositozunu indükleyen sinaps kurulur. Salınan perforin ve granzim molekülleri sonunda hedef hücrenin apoptozu ile sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
ADCC de dahil olmak üzere sitotoksisiteyi ölçmek için daha önce çeşitli testler geliştirilmiştir. Altın standart, hedef hücrelerin radyoaktif 51Cr izotopu ile etiketlendiği radyoaktif krom salınım yöntemidir ve ADCC, lize edilmiş hedef hücrelerin süpernatantından radyoaktivite ölçülerek ölçülür11. Radyoaktif farmasötiklerin ve atıkların sıkı bir şekilde düzenlenmesi, depolanması ve bertaraf edilmesinden kaynaklanan bariz sorunlar nedeniyle, bu yöntem yaşam bilimcileri arasında giderek daha popüler hale gelmemiştir. Ayrıca, yüksek verimli uygulamalar için de uygun değildir. Öldürülen hedef hücrelerden salınan enzimlerin (örneğin, laktat-dehidrojenaz) aktivitesinin ölçülmesi, 51Cr testi12’ye radyoaktif olmayan bir alternatif sağlayabilir. Bununla birlikte, bu tahliller hedef ve efektör hücre ölümlerini ayırt etmekte başarısız olmaktadır. Elektrik Hücresi-substrat Empedans Algılama (ECIS), ADCC13’ün nicelleştirilmesi için uygun olduğunu kanıtladı, ancak ECIS ekipmanı çoğu laboratuvarda mevcut değildir ve teknik, yüksek verimli uygulamalar / tarama ile uyumlu değildir. Floresan olarak etiketlenmiş hücreler, birçok hücre biyolojisi tahlilinde popüler bir alternatiftir ve genellikle akış sitometrisinde veya plaka okuyucu tabanlı uygulamalarda kullanılır14,15,16. Bununla birlikte, bu testler genellikle yıkama adımları içerir veya yüksek verimli uygulamalarla (örneğin, akış sitometrisine dayalı teknikler) uyumsuzdur. Teoride ADCC nicelleştirmesi için uygun olması gereken bazı popüler sitotoksisite testleri, ADCC verimliliğini güvenilir bir şekilde belirleyememektedir13. Son zamanlarda, floresan konfokal mikroskopinin yayılmasıyla, görüntü tabanlı, yüksek içerikli analizler yaşam bilimlerinin çeşitli alanlarında giderek daha popüler hale gelmektedir17. Bir yandan, hücre görüntüleme ekipmanı artık oldukça yaygınken, diğer yandan, elde edilen görüntülerden neredeyse sonsuz morfolojik parametreler toplanabilir. Bu nedenle, yüksek içerikli tarama uyumlu bir ADCC testi geliştirmek ve bileşik kütüphane taramasına uygunluğunu göstermek için yola çıktık.
Burada, görüntü tabanlı bir ADCC testi sunuyoruz ve bu tahlilin ADCC modüle edici bileşikleri tanımlamak için Yüksek İçerik Taraması (HCS) için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Model, JIMT-1 meme karsinomu hedef hücrelerine, CD16.176V.NK-92 efektör hücrelerine ve insanlaştırılmış monoklonal anti-HER2 antikoru trastuzumab’a dayanmaktadır. Bu yöntemle, NK hücrelerinin tümör öldürme etkisini artırabilecek ilaçları tanımlamak veya ADCC’ye müdahale eden küçük molekülleri tanımlayarak NK hücre aracılı ADCC’nin mekanizması hakkında fikir edinmek mümkündür. ADCC’ye özel olarak hücre aracılı sitotoksisiteyi ölçmeyi amaçlayan yaşam bilimcilerinin, bu tahlili keşif bilimi veya ilaç geliştirme için kullanmaktan fayda sağlayabileceğini öneriyoruz. Bu tahlil, bir laboratuvarın floresan görüntüleme ve kantitatif görüntü analizine erişimi ve bu konuda bazı deneyimleri varsa alternatif olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADCC reaksiyonu nispeten uzun zaman önce tanımlanmıştır. Sürecin anahtar moleküler olayları da tanımlanmıştır19. ADCC’yi ölçme yöntemleri, altın standart radyoaktif krom salınım testinden, sitoplazmik enzim salınım testlerinden birkaç floresan bazlı akış sitometrisine veya mikroplaka tahlillerinekadar uzanır 20. Bununla birlikte, bu testlerin ortak bir sınırlaması, yüksek verimli uygulamalara uygun olmamalarıdır. Daha önce, ADCC modifiye edic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV, Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi’nden GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS”, GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ve OTKA K132193, K147482 hibelerinden fon aldı. CD16.176V.NK-92 hücreleri Dr. Kerry S. Campbell’den (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), dünya çapında patentlerle korunmaktadır ve Nantkwest, lnc tarafından lisanslanmıştır. Yazarlar, NK-92 hücre hattının kullanımı ve teknik tavsiyeler için György Vereb ve Árpád Szöőr’e teşekkür eder.
Materials
| 5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
| 96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
| Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
| CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
| Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
| Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
| Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
| Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
| DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
| Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
| Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
| Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| Harmony software | PerkinElmer | ||
| Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
| Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
| IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
| Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
| NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
| Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
| Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
| Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
| Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
| Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
| Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
| α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
References
- Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
- Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
- Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
- Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
- Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
- Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
- Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
- Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
- van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
- Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
- Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
- Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
- Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
- Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
- Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
- Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
- Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).
