原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

Summary

原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、ナノスケールのAFMプローブ先端とサンプル表面との相互作用を根本的に測定します。プローブ先端によって加えられる力とそのサンプルとの接触面積を定量化できれば、プローブされる表面のナノスケールの機械的特性(弾性率やヤング率など)を決定することができます。ここでは、定量的AFMカンチレバーベースのナノインデンテーション実験を実行するための詳細な手順を、kPaからGPaまでのさまざまなサンプルタイプの弾性率を決定するためにこの手法を適用する方法の代表的な例とともに提供します。これらには、生きた間葉系幹細胞(MSC)と生理学的バッファー中の核、樹脂が埋め込まれた脱水ロブロリーパイン断面、およびさまざまな組成のバッケン頁岩が含まれます。

さらに、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを使用して、リン脂質二重層の破断強度(すなわち、突破力)を調査します。メソッドの選択と開発、プローブの選択とキャリブレーション、関心領域の識別、サンプルの不均一性、フィーチャーサイズとアスペクト比、チップの摩耗、表面粗さ、データ分析と測定統計などの重要な実用的な考慮事項について説明し、テクニックの適切な実装を支援します。最後に、AFM由来のナノメカニカルマップと、元素組成に関する追加情報を提供する電子顕微鏡技術との共局在化が実証されます。

Introduction

材料の機械的特性を理解することは、工学における最も基本的で不可欠なタスクの1つです。バルク材料特性の解析には、引張試験¹、圧縮試験²、3点または4点曲げ(曲げ)試験³など、材料システムの機械的特性を特徴付けるために利用できる多数の方法があります。これらのマイクロスケール試験は、バルク材料特性に関する貴重な情報を提供できますが、一般的に故障するために実施されるため、破壊的です。さらに、薄膜、生体材料、ナノコンポジットなど、今日注目されている多くの材料システムのマイクロおよびナノスケールの特性を正確に調査するために必要な空間分解能が不足しています。大規模な機械的試験、主にその破壊的な性質のいくつかの問題に対処し始めるために、鉱物学から微小硬度試験が採用されました。硬度は、特定の条件下での塑性変形に対する材料の耐性の尺度です。一般に、微小硬さ試験では、通常は硬化鋼またはダイヤモンドで作られた硬いプローブを使用して、材料にインデントします。結果として生じるくぼみの深さおよび/または面積を使用して、硬度を決定することができます。ビッカース⁴、ヌープ⁵、ブリネル⁶ 硬度など、いくつかの方法が開発されています。それぞれがマイクロスケールの材料硬度の尺度を提供しますが、異なる条件と定義の下で、そのため、同じ条件下で実行されたテストと比較できるデータのみを生成します。

計装ナノインデンテーションは、さまざまな微小硬度試験方法で得られた相対値を改善し、機械的特性の分析に可能な空間分解能を向上させ、薄膜の分析を可能にするために開発されました。重要なことに、OliverとPharr⁷によって最初に開発された方法を利用することにより、サンプル材料の弾性率またはヤング率Eを計装されたナノインデンテーションを介して決定できます。さらに、Berkovich 3面ピラミッド型ナノインデンタープローブ(理想的な先端面積関数がビッカース4面ピラミッド型プローブと一致する)⁸を採用することで、ナノスケールと従来のマイクロスケール硬度測定を直接比較することができます。AFMの人気が高まるにつれ、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションも、特に柔らかい材料の機械的特性を測定するために注目され始めました。その結果、図1に模式的に示されているように、ナノスケールの機械的特性を調査および定量化するために今日最も一般的に採用されている2つの技術は、計装化されたナノインデンテーション(図1A)とAFMカンチレバーベースのナノインデンテーション(図1B)⁹であり、後者はこの研究の焦点です。

図1:計装システムとAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションシステムの比較。 (A)計装ナノインデンテーションおよび(B)AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実施するための典型的なシステムを示す概略図。この図はQianら⁵¹から修正された。略称:AFM =原子間力顕微鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

計装およびAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションはどちらも、剛性プローブを使用して目的のサンプル表面を変形させ、時間の関数として合力と変位を監視します。通常、所望の荷重(すなわち、力)または(Zピエゾ)変位プロファイルのいずれかがソフトウェアインターフェース を介して ユーザーによって指定され、機器によって直接制御され、他のパラメータが測定される。ナノインデンテーション実験から最も頻繁に得られる機械的特性は、圧力の単位を有するヤング率とも呼ばれる弾性率(E)である。材料の弾性率は、接着剛性に関する基本的な特性であり、塑性変形が始まる前の弾性(可逆的または一時的な)変形中の軸ひずみ(ε、くぼみ軸に沿った比例変形)に対する引張応力または圧縮応力(σ、単位面積あたりの適用力)の比率として定義されます(式[1])。

(1)

多くの材料(特に生体組織)は実際には粘弾性であるため、実際には、(動的または複雑な)弾性率は弾性(貯蔵、位相内)と粘性(損失、位相外)成分の両方からなることに注意する必要があります。実際には、ナノインデンテーション実験で測定されるのは、式(2)に示すように、対象の真のサンプル弾性率Eに関連する還元弾性率E*です。

(2)

ここで、E_チップとνチップはそれぞれナノインデンター_チップの弾性率とポアソン比であり、νはサンプルの推定ポアソン比です。ポアソン比は、横ひずみと軸ひずみの負の比であるため、式(3)に示すように、軸ひずみを受けたとき(ナノインデンテーション荷重時など)のサンプルの横方向の伸びの程度を示します。

(3)

a)圧子先端によって与えられる軸ひずみの一部が横ひずみに変換される可能性がある(すなわち、試料が荷重方向に垂直な膨張または収縮によって変形する可能性がある)、およびb)圧子先端が無限に硬くないため、したがって、試料をインデントする行為は、先端のいくらかの(小さな)変形をもたらすので、減少弾性率から実際の弾性率への変換が必要である。E_チップがE>>場合(つまり、圧子チップがサンプルよりもはるかに硬い場合、ダイヤモンドプローブを使用する場合によく当てはまります)、減少したサンプル弾性率と実際のサンプル弾性率の関係は、E≈E*(1-v2)に大きく単純化されます。インストルメンテーションされたナノインデンテーションは、正確な力の特性評価とダイナミックレンジの点で優れていますが、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは高速で、桁違いに大きな力と変位の感度を提供し、より高い解像度のイメージングと改善されたインデンテーションの位置特定を可能にし、ナノスケールの磁気特性と電気的特性を同時にプローブできます⁹.特に、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは、柔らかい材料(ポリマー、ゲル、脂質二重層、細胞または他の生物学的材料など)、非常に薄い(サブμm)フィルム(くぼみの深さに応じて基質効果が作用する)^10,11、およびグラフェンなどの懸濁された2次元(2D)材料^12,13,14のナノスケールでの機械的特性の定量化に優れています^15,16、雲母¹⁷、六方晶窒化ホウ素(h-BN)¹⁸、または遷移金属ダイカルコゲナイド(TMDC;例えば、_MoS2)¹⁹。これは、その絶妙な力(sub-nN)と変位(sub-nm)感度によるものであり、初期接触点を正確に決定し、弾性変形領域内に留まるために重要です。

AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションでは、AFMプローブの試料表面への変位は、較正された圧電素子(図1B)によって作動し、フレキシブルカンチレバーは、試料表面との接触時に受ける抵抗力により最終的に曲がります。カンチレバーのこの曲がりまたはたわみは、通常、カンチレバーの背面から光検出器(位置検出器[PSD])にレーザーを反射することによって監視されます。片持ち梁の剛性(nN/nm)とたわみ感度(nm/V)の知識と組み合わせることで、この測定された片持ち梁のたわみ(V)をサンプルに加えられた力(nN)に変換することができます。接触後、Zピエゾの動きとカンチレバーのたわみの差により、サンプルのくぼみの深さが得られます。チップ面積関数の知識と組み合わせることで、チップとサンプルの接触面積の計算が可能になります。次に、結果として得られる力-距離または力-変位(F-D)曲線の接触部分の傾きを、適切な接触力学モデル(説明の 「データ分析 」セクションを参照)を使用して適合し、サンプルのナノ機械的特性を決定できます。AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは、上記のように計装されたナノインデンテーションに比べていくつかの明確な利点がありますが、ここで説明するキャリブレーション、チップ摩耗、データ分析など、いくつかの実用的な実装上の課題も提示します。AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションのもう1つの潜在的な欠点は、接触半径とくぼみ深さが圧子半径よりもはるかに小さくする必要があるため、線形弾性の仮定であり、ナノスケールのAFMプローブや大きな表面粗さを示すサンプルで作業する場合、これを達成するのは難しい場合があります。

従来、ナノインデンテーションは、個々の場所または小さなグリッドインデンテーション実験に限定されており、所望の位置(すなわち、関心領域[ROI])が選択され、単一の制御されたインデント、いくつかの待ち時間で区切られた単一のロケーション内の複数のインデント、および/またはインデントの粗いグリッドがHzのオーダーの速度で実行される。しかし、近年のAFMの進歩により、荷重制御下でkHzの速度で力曲線を伝導し、最大先端サンプル力をイメージング設定値として利用する高速力曲線ベースのイメージングモード(システムメーカーによってさまざまな商品名で呼ばれる)を利用して、機械的特性とトポグラフィーを同時に取得できるようになりました。ポイントアンドシュート法も開発されており、AFMトポグラフィ画像を取得した後、画像内の関心のあるポイントで選択的なナノインデンテーションを可能にし、ナノインデンテーション位置のナノスケール空間制御を可能にします。この研究の主な焦点ではありませんが、力曲線ベースのイメージングとポイントアンドシュートカンチレバーベースのナノインデンテーションの両方の特定の 選択されたアプリケーション例 が代表的な結果に提示されており、採用されている特定のAFMプラットフォームで利用可能な場合は、以下に概説するプロトコルと組み合わせて使用できます。具体的には、この作業では、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを任意の可能なAFMシステムに実際に実装するための一般化されたプロトコルの概要を説明し、代表的な結果とニュアンス、課題、および技術を成功させるための重要な考慮事項の詳細な議論を含む、技術の4つのユースケース例(空気中2つ、流体中2つ)を提供します。

Protocol

注:市販のAFMは多種多様であり、カンチレバーベースのナノインデンテーションにはサンプルタイプと用途が多様であるため、以下のプロトコルは、機器やメーカーに関係なく、すべてのカンチレバーベースのナノインデンテーション実験に必要な共有ステップに焦点を当てて、本質的に比較的一般的になるように意図的に設計されています。このため、著者らは、読者がカンチレバーベース…

Representative Results

力-変位曲線図7は、樹脂が埋め込まれたロブロリーマツサンプル(図7A)および間葉系幹細胞(MSC)核上の流体(リン酸緩衝生理食塩水[PBS])(図7B)で空気中で行われたナノインデンテーション実験から得られた代表的なほぼ理想的なF-D曲線を示しています。接触力学モデルの使用は、最初のチップとサンプルの接触点の…

Discussion

サンプル調製
空気中のナノインデンテーションの場合、一般的な調製方法には、凍結切片(例えば、組織サンプル)、粉砕および/または研磨とそれに続くウルトラミクロトミング(例えば、樹脂包埋生物学的サンプル)、イオンミリングまたは集束イオンビーム調製(例えば、研磨に適さない半導体、多孔質、または混合硬度サンプル)、機械的または電気化学的研磨(例えば、金属?…

Materials

Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E – 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI – T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.