Velocidade de Hemossedimentação: Uma Caracterização Física em um Contexto Médico

Summary

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é um parâmetro físico, frequentemente utilizado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Um modelo teórico que permite extrair parâmetros fisicamente significativos de toda a curva de sedimentação, baseado no conhecimento coloidal moderno, foi recentemente desenvolvido. Aqui, apresentamos um protocolo para coletar automaticamente a VHS ao longo do tempo, e extrair os parâmetros desse modelo recente dessa coleta automatizada de dados. Esses parâmetros refinados também tendem a melhorar o testemunho médico.

Abstract

A velocidade de sedimentação eritrocitária (ou eritrócitos) (VHS) é um parâmetro físico derivado do sangue que é frequentemente usado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Por exemplo, no caso de inflamação, observa-se uma VHS mais elevada devido ao aumento associado do fibrinogênio e de outras proteínas plasmáticas. Acreditava-se que esse aumento se devesse à formação de maiores agregados de hemácias (hemácias) causada pelo aumento do fibrinogênio. De fato, o fibrinogênio é uma agregação de hemácias promotora de agentes e, no regime de Stokes, supõe-se que seja observada em sedimentos de agregados maiores do sangue mais rapidamente. No entanto, todos os modelos de medidas de VHS baseados nessa hipótese requerem pressupostos físicos específicos, não exigidos em nenhum outro sistema. Além disso, estudos modernos no campo das suspensões coloidais estabeleceram que partículas atrativas formam agregados percolantes (ou seja, agregados tão largos quanto o recipiente). A sedimentação desses coloides segue-se então a um chamado “colapso do gel coloidal”. Recentemente, foi demonstrado que as hemácias realmente seguem o mesmo comportamento. Essa hipótese também permite modelar de forma eficiente e analítica a curva de sedimentação de hemácias, a partir da qual descritores robustos e fisicamente significativos podem ser extraídos. Este artigo descreve como realizar tal análise e discute os benefícios dessa abordagem.

Introduction

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é uma ferramenta clínica médica in vitro, formalmente introduzida na medicina baseada em evidências durante o século XX1,2,3,4. Atualmente, é utilizada mundialmente como teste inflamatório inespecífico, ou para monitorar a evolução de algumas condições específicas5,6,7,8. Isso se deve principalmente ao aumento da concentração de fibrinogênio, mas também de outros componentes plasmáticos, como a IgM 1,9,10,11. De acordo com o protocolo padrão de Westergren atual, os valores de VHS são relatados como a medida da camada de plasma livre de células em um determinado momento (30 min ou 1 h) após deixar um tubo vertical de tamanho típico de 20 cm verticalmente em repouso¹². No entanto, esse método de medição tem sido criticado, uma vez que qualitativamente diferentes etapas do processo de sedimentação têm sido relatadas, incluindo um atraso antes de atingir a velocidade máxima de sedimentação¹³. Esse atraso dura mais de 1 h em aproximadamente metade das amostras saudáveis¹⁴. A velocidade durante essa fase obedece a uma escala diferente da segunda fase mais rápida da sedimentação¹⁵. Restringir a leitura à velocidade média de sedimentação durante a primeira hora compara uma mistura diferente de várias propriedades do sangue entre indivíduos diferentes.

Além disso, recentemente foi demonstrado que as considerações teóricas usuais por trás desse protocolo estavam erradas^16,17,18. No hematócrito fisiológico (acima de aproximadamente 25%), as hemácias (hemácias) não se sedimentam como agregados separados, mas sim como uma rede contínua, denominada percolante, de hemácias 17,18, obedecendo a um conjunto de equações físicas diferente da usualmente citada sedimentação de Stokes ^16,17. Demonstrou-se que considerar uma descrição física baseada nas medidas resolvidas no tempo da sedimentação (curva inteira) foi mais robusto em alguns contextos médicos novos^19,20. Além disso, essas medidas poderiam ser usadas para esclarecer os mecanismos físicos que alteram a VHS em patologias nas quais as formas celulares são alteradas^19,20. Além disso, uma VHS lenta pode ter uma interpretação médica útil, como indicado nas medidas de uma coorte de pacientes com síndrome de neuroacantocitose^19,20. Este artigo revisa como implementar na prática a medição de parâmetros fisicamente significativos, com base em toda a cinética de VHS. Mais precisamente, o método aqui apresentado extrai a velocidade máxima de sedimentação U_m, cujo valor pode ser corrigido para considerar o efeito do hematócrito do doador^16,17. Esse parâmetro é mais preciso e, portanto, mais confiável que a medida tradicional^16,17,19,20.

Além disso, em algumas pesquisas fundamentais, ao invés de monitorar o estado inflamatório de um determinado paciente, é interessante excluir o efeito do hematócrito sobre a VHS 21,22,23, ou investigar o papel das hemácias em uma VHS modificada 19,20,24,25 entre diferentes doadores. Pode ser útil comparar amostras que não são diretamente amostras de sangue cheias de pacientes. Portanto, a ressuspensão de hemácias com hematócrito controlado no plasma autólogo ou substituinte plasmático pode ser usada como o primeiro passo da medida da VHS. Por exemplo, soluções de Dextran 70 kDa com concentração de 55 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) produzem uma faixa de sedimentação dentro da faixa de controle para células saudáveis¹⁹. Este manuscrito também mostra como tais etapas devem ser conduzidas, e que a análise apresentada também é relevante nesses casos.

Protocol

A coleta de amostras de sangue e os experimentos foram aprovados pela “Ärztekammer des Saarlandes”, ética votum 51/18, e realizados após a obtenção do consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. As medições padrão devem ser realizadas com sangue anticoagulado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração padrão de EDTA de 1,6 mg/mL de sangue, norma europeia NF EN ISO 6710), em tubos de Westergren. O volume necessário para encher o tubo de Westergren depende do fabricante (j…

Representative Results

Um exemplo de uma sequência de imagens adquirida corretamente é fornecido como Filme Suplementar 1 (MovieS1.avi). Uma série de ajustes característicos do modelo é mostrada para várias condições na Figura 2. A concentração de fibrinogênio foi determinada a partir da concentração de fibrinogênio no plasma Fib0, assumindo que o soro não possui fibrinogênio. Assim, Fib = C Fib0, onde C é a fração de volume plasm…

Discussion

Para que o protocolo automatizado funcione de forma eficiente, é importante ter um fundo claro e iluminação adequada. Um fundo escuro pode impedir a existência de um limiar de binarização eficiente. Para amostras com alguma hemólise, que geralmente ocorre (aumenta) ao longo do tempo, é importante verificar primeiro se o limiar de binarização escolhido é relevante tanto para as imagens iniciais quanto para as finais.

Quando se trata do processo de binarização da imagem, a escolha d…

Materials

Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 – Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.