이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
만능 줄기 세포는 체외 질병 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 유용한 복잡한 조직 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자가 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템에서 망막 오가노이드를 생성하는 더 간단하고 강력하며 단계적인 방법을 설명합니다. 또한, 각 EFP 내의 도넛 모양, 원형 및 반투명 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 망막 분화 배지에서 1-2주 동안 비부착성 배양 접시를 사용하여 현탁액 하에서 배양하여 다층 3D 광학 컵(OC-1M)을 생성합니다. 이 미성숙 망막 오가노이드는 PAX6+ 및 ChX10+ 증식, 다능성 망막 전구체를 함유하고 있습니다. 전구체 세포는 오가노이드 내에서 선형적으로 자가 조립되며 뚜렷한 방사형 줄무늬로 나타납니다. 현탁 배양 후 4주에 망막 전구체는 유사분열 후 정지 및 계통 분화를 거쳐 성숙한 망막 오가노이드(OC-2M)를 형성합니다. 광수용체 계통 커밋된 전구체는 망막 오가노이드의 가장 바깥쪽 층 내에서 발생합니다. 이러한 CRX+ 및 RCVRN+ 광수용체 세포는 형태학적으로 성숙하여 내부 세그먼트와 같은 확장을 표시합니다. 이 방법은 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 유도만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 망막 오가노이드를 생성하는 데 채택할 수 있습니다. 모든 단계와 절차는 복제 가능성을 보장하고 기초 과학 및 중개 연구에서 더 넓은 응용 분야를 위해 명확하게 설명되고 시연됩니다.
서론
망막은 척추동물의 눈 뒤쪽에 존재하는 빛에 민감한 조직으로, 광전달 경로로 알려진 생화학적 현상에 의해 빛 신호를 신경 자극으로 변환합니다. 망막의 광수용체 세포에서 생성된 초기 신경 자극은 다른 망막 중간 뉴런과 망막 신경절 세포(RGC)로 변환되어 뇌의 시각 피질에 도달하여 이미지 인식 및 시각 반응을 돕습니다.
세계보건기구(WHO)에 따르면 약 150만 명의 어린이가 맹인이며 그 중 100만 명이 아시아에 있습니다. 유전성 망막 이영양증(Inherited Retinal Dystrophy, IRD)은 전 세계 인구 4,000명 중 1명에게 영향을 미치는 주요 실명 질환이며1,2,3, 개발도상국에서는 연령 관련 황반변성(AMD)과 관련된 실명 유병률이 0.6%-1.1%에 이른다4. IRD는 망막 발달 및 기능에 관여하는 300개 이상의 서로 다른 유전자의 유전적 결함에 의해 발생한다5. 이러한 유전적 변화는 정상적인 망막 기능의 파괴와 망막 세포, 즉 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
hiPSC와 관련된 모든 실험은 표준 실험실 관행, 윤리 및 생물 안전 지침을 준수하고 기관 윤리 위원회(IEC), 줄기 세포 연구를 위한 기관 위원회(IC-SCR) 및 기관 생물 안전 위원회(IBSC)와 같은 규제 기관의 승인을 받아 무균적으로 수행되었습니다.
1. iPSC 배양액과 망막 분화 배지 및 시약의 제조
- iPSC 배양 및 유지 배지
- 배양 및 정상 hiPSC 라인23 (hiPSC-F2-3F1) 및 CRISPR 편집된, RB1-/- hiPSC 라인 (LVIP15-RB1-CS3, 인간 RB1 유전자의 엑손 18 내에서 이중대립유전자, 프레임시프트 결실 10 bp)을 피더-없는 배양 조건 하에서 마트리겔 코팅 (basement membrane matrix coated; Table of Materials) 배양 플레이트 상에서 유지하였다.
참고: 이 프로토콜은 기저막 매트릭스를 재조합 비트로넥틴(VTN-N) 코팅으로 교체하여 완전히 이종-제로 만들 수 있습니다. 50x Essential 8 보충제(Essential 8 배지 키트와 함께 제공됨, 재료 표....
- 배양 및 정상 hiPSC 라인23 (hiPSC-F2-3F1) 및 CRISPR 편집된, RB1-/- hiPSC 라인 (LVIP15-RB1-CS3, 인간 RB1 유전자의 엑손 18 내에서 이중대립유전자, 프레임시프트 결실 10 bp)을 피더-없는 배양 조건 하에서 마트리겔 코팅 (basement membrane matrix coated; Table of Materials) 배양 플레이트 상에서 유지하였다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
hiPSC를 눈 계통으로 분화하는 것은 그림 1에 설명된 바와 같이 보충제와 성장 인자를 포함하는 다양한 배양 배지에서 세포를 서로 다른 시점에서 순차적인 단계로 배양함으로써 달성됩니다. 상기 hiPSC 배양물은 만능줄기세포 유지 배지인 Essential 8 배지에서 유지된다. 70%-80% 밀도에 도달하면(그림 2A), 배지는 0일(3.2단계 참조)에 1ng/mL bFGF, 1ng/mL Noggin 및 1% N2 보충제를 포함하는 분화 유도 배지(DIM)로 교체됩니다. 신경 유도 N2 보충제와 함께 BMP 신호 전달 억제제 인 Noggin은 중배엽 및 내배엽 투입을 차단하여 세포를 신경 외배엽 계통으로 유도하는 데 중요한 역할을합니다. 1일, 2일,3 일에 Noggin의 농도가 10 ng / mL로 증가합니다 (3.3 및 3.4 단계 참조). 4일째
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
hiPSC는 시험관 내에서 장기 및 조직 발달을 연구하는 강력한 도구입니다. 건강한 hiPSC와 질병 특이적 hiPSC를 망막 계통으로 구별하여 질병 표현형을 요약하면 다양한 형태의 유전성 망막 이영양증의 병태생리학에 대한 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. PSC를 망막 세포 유형으로의 시험관 내 분화를 위해 여러 프로토콜이 설명되고 채택되었습니다. 대부분은 N1, N2 및 B27 보충제와 같은 재조합 성장 인자, 보충제, 소분자 및 시약의 복잡한 칵테일을 포함하는 배양 배지의 사용을 포함합니다. BMP 및 TGFβ 신호전달 차단제, 예컨대 Noggin, SB431542, LDN193189, 및 폴리스타틴, 또는 유도제, 예컨대 Activin A, Lefty, 및 IDE1; DKK1, SFRP, IWP-2 및 IWR-1-endo와 같은 표준 Wnt 신호 차단제 또는 CHIR99021, SB216763 및 CKI-7과 같은 유도제; FGF 수용체 신호전달 차단제, 예컨대 PD0325.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
모든 저자는 이해 상충이나 재무 공개가 없습니다.
감사의 글
저자는 유전학자인 Dr. Chitra Kannabiran의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다. Subhadra Jalali 박사, 망막 컨설턴트; Milind Naik 박사, 안과 성형 외과 의사; 하이데라바드에 있는 LV Prasad Eye Institute의 안과 종양 전문의인 Dr. Swathi Kaliki는 정상 및 환자 맞춤형 iPSC 라인 생성을 위해 노력하고 있습니다. 저자는 과학 및 공학 연구위원회, 과학 기술부 (IM), (SB / SO / HS / 177 / 2013), 생명 공학부 (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) 및 ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) 및 CSIR (V.K.P.), 인도 정부의 선임 연구원.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 주사기 필터 | TPP | 99722 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | TPP | 91015 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 항체; 마우스 단클론 | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 희석 |
| Anti-CRX 항체; 토끼 단클론 | Abcam | ab140603 | 1:300 희석 |
| Anti-MiTF 항체, 마우스 단클론 | Abcam | ab3201 | 1:250 희석 |
| Anti-Recoverin 항체; 토끼 다클론성 | Millipore | AB5585 | 1:300 희석 |
| B-27 보충제(50개), 무혈청 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| 원심분리기 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar(50mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스 | 코닝 | ||
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco' s 인산염 완충 식염 | Thermo Fisher | 14190144 | |
| 필수 8 매체 키트 | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Petri Dish, 60 mm | 코닝 | 351007 | |
| 태아 소 혈청, 자격, 미국 | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+와 이미지 랩 소프트웨어 | BIO-RAD | Agarose Gel 문서화 시스템 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher | 35050061 | |
| 염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1 : 300 희석 |
| 염소 항 마우스 IgG (H + L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1 : 300 희석 |
| 염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1 : 300 희석 |
| 염소 항 토끼 IgG (H + L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 희석 |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 보충제 (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | RNA | |
| 파라포름알데히드 | 퀄리겐 | 23995 | |
| 파스퇴르 피펫, 9인치, 비멸균, 언플러그 | 코닝 | 7095D-9 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| 재조합 Anti-Otx2 항체, 토끼 단클론 | Abcam | ab183951 | 1:300 희석 |
| 재조합 Anti-PAX6 항체; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 희석 |
| 재조합 Anti-RPE65 항체, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 희석 |
| 재조합 인간 Noggin 단백질 | R& D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| 혈청 피펫 10 mL | TPP | 94010 | |
| 혈청 피펫 5 mL | TPP | 94005 | |
| 염화나트륨 | 시그마 Aldrich | S7653 | |
| 구연산 나트륨 삼염 이수화물 | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost ( 실란 코팅) 현미경 슬라이드 | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol 시약 | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | 벡터 연구소 | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | 컨포칼 현미경 |
참고문헌
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
