Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries
Summary
Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.
Introduction
La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à balais (Sarothamnus scoparius), l’oignon (Allium cepa), les épinards (Spinacia oleracea), la pensée (Viola tricolor), le poivre (Capsicum annuum) et le pois (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Une méthode mise à jour pour isoler les plastoglobules chloroplastiques d’une manière plus efficace et plus efficace a été présentée plus tard par Ytterberg et coll.3,14. Alors qu’initialement utilisé pour l’étude des plastoglobules des chloroplastes des feuilles d’Arabidopsis thaliana, nous avons utilisé avec succès cette méthode mise à jour pour les tissus foliaires sains d’autres espèces végétales, à la fois monocotylédones et dicotylédones, y compris le maïs (Zea mays), la tomate (Solanum lycopersicum), l’herbe d’amour (Eragrostis nindensis), le faux brome pourpre (Brachypodium distachyon) et le tabac sauvage (Nicotiana benthamiana ; résultats non publiés). De plus, la méthode d’isolement a été adaptée avec succès aux plastoglobules des cyanobactéries, y compris Synechocystis sp. PCC 6803 et Anabaena sp. PCC 712015, et au tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, E. nindensis.
Les plastoglobules chloroplastiques du tissu foliaire sain sont physiquement connectés aux membranes thylakoïdes16. Malgré cette continuité physique, les deux sous-compartiments chloroplastiques conservent des compositions lipidiques et protéiques distinctes, bien que l’échange régulé de lipides et de protéines entre les deux compartiments ait été proposé 2,4,17,18,19. En fait, un modèle d’hémifusion intéressant a récemment été proposé pour le trafic de lipides neutres entre les chloroplastes et le cytosol19. En raison de la continuité physique des plastoglobules et des thylakoïdes, la méthode d’isolement avec du tissu foliaire sain commence par la collecte d’une préparation de thylakoïdes bruts en granulés, qui est ensuite soniquée pour séparer les plastoglobules des thylakoïdes, contrairement aux méthodes utilisées pour isoler les gouttelettes lipidiques cytosoliques20 . L’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose fait ensuite flotter les plastoglobules de faible densité à travers le saccharose, les séparant efficacement des thylakoïdes, des noyaux et d’autres matériaux à haute densité. En revanche, les plastoglobules dans les cyanobactéries, ainsi que ceux des tissus foliaires desséchés, existent évidemment in vivo sous une forme flottante librement. Par conséquent, leur isolement implique de flotter directement sur un gradient de saccharose. Cet article démontre la méthode d’isolement à partir de tissus foliaires sains et démontre en outre deux variantes qui peuvent être utilisées pour isoler des plastoglobules à partir de tissus foliaires desséchés ou de cultures de cyanobactéries, élargissant considérablement l’étendue physiologique et le contexte évolutif dans lequel les plastoglobules peuvent être étudiés.
Les plastoglobules isolés peuvent ensuite être utilisés pour un certain nombre d’analyses en aval afin d’étudier les caractéristiques moléculaires. Nous avons utilisé les plastoglobules isolés du tissu foliaire d’A. thaliana pour une analyse protéomique et lipidomique approfondie dans différentes conditions environnementales ou génotypes, démontrant la modification sélective de la composition protéique et lipidique en adaptation au stress 2,4,21,22. En outre, des essais in vitro kinases démontrant une activité de transphosphorylation associée à des plastoglobules isolés ont été effectués22, les états oligomères des composants protéiques ont été étudiés à l’aide de l’électrophorèse sur gel natif 21 et des tests de rasage de protéase ont été effectués23.
Le principal avantage de cette méthode est la vitesse relative de la procédure. D’après notre expérience, les protocoles décrits ci-dessous peuvent être entièrement complétés en environ 4 heures. Une autre méthode pour isoler les plastoglobules du tissu foliaire a été décrite, ce qui permet l’isolement simultané d’autres sous-compartiments chloroplastiques24. Cette méthode alternative offre des avantages évidents lorsque la comparaison quantitative avec les autres sous-compartiments chloroplastiques est nécessaire ou souhaitée. Cependant, cette méthode alternative est également plus fastidieuse et fournira un rendement significativement plus faible de plastoglobules isolés à partir de quantités comparables de tissu foliaire. Lorsqu’une étude ciblée des plastoglobules est l’objectif, la méthodologie décrite ici est le choix optimal. Néanmoins, des aliquotes totales de feuilles et de thylakoïdes bruts peuvent être recueillies pendant la préparation de l’échantillon, et il est fortement recommandé de le faire, afin de disposer d’échantillons de référence pour une comparaison ultérieure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le groupe de laboratoire Lundquist est soutenue par des subventions de la NSF (MCB-2034631) et de l’USDA (MICL08607) à P.K.L. Les auteurs remercient la Dre Carrie Hiser (MSU) pour son soutien dans le développement de la méthode d’isolement des plastoglobules cyanobactériens.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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