Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien
Summary
Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.
Abstract
Plastoglobuläre Lipidtröpfchen sind ein dynamisches Unterkompartiment von pflanzlichen Chloroplasten und Cyanobakterien. Es wird angenommen, dass sie ubiquitär unter photosynthetischen Arten vorkommen und eine zentrale Rolle bei der Anpassung und dem Umbau der Thylakoidmembran unter sich schnell ändernden Umweltbedingungen spielen. Die Fähigkeit, Plastoglobulen von hoher Reinheit zu isolieren, hat ihre Untersuchung durch proteomische, lipidomische und andere Methoden erheblich erleichtert. Mit Plastoglobuli von hoher Reinheit und Ausbeute ist es möglich, ihre Lipid- und Proteinzusammensetzung, enzymatische Aktivität und Proteintopologie sowie andere mögliche molekulare Eigenschaften zu untersuchen. Dieser Artikel stellt ein schnelles und effektives Protokoll für die Isolierung von Plastoglobuli aus Chloroplasten von pflanzlichem Blattgewebe vor und stellt methodische Variationen für die Isolierung von Plastoglobulen und verwandten Lipidtröpfchenstrukturen aus Maisblättern, dem ausgetrockneten Blattgewebe der Auferstehungspflanze, Eragrostis nindensis, und dem Cyanobakterium, Synechocystis , vor PCC 6803. Die Isolierung beruht auf der geringen Dichte dieser lipidreichen Partikel, was ihre Reinigung durch Saccharosedichteflotation erleichtert. Diese Methodik wird sich bei der Untersuchung von Plastoglobuli verschiedener Arten als wertvoll erweisen.
Introduction
Das aktuelle Verständnis der Zusammensetzung und Funktion von Plastoglobulen ist durch detaillierte proteomische und lipidomische Studien entstanden 1,2,3,4,5. Solche Studien wurden durch eine schnelle und effektive Isolierungsmethode erheblich unterstützt, die auf ihrer sehr geringen Dichte für eine effiziente Trennung unter Verwendung von Saccharosegradienten beruht. Erste Methoden zur Isolierung von Plastoglobulen wurden von Arten wie Buche (Fagus sylvatica), Ginster (Sarothamnus scoparius), Zwiebel (Allium cepa), Spinat (Spinacia oleracea), Stiefmütterchen (Viola tricolor), Pfeffer (Capsicum annuum) und Erbsen (Pisum sativum) erreicht6,7,8,9,10,11 ,12,13. Eine aktualisierte Methode, um Chloroplasten-Plastoglobuli effizienter und ertragreicher zu isolieren, wurde später von Ytterberg et al.3,14 vorgestellt. Während wir ursprünglich für die Untersuchung der Plastoglobulen von Arabidopsis thaliana Blattchloroplasten eingesetzt wurden, haben wir diese aktualisierte Methode erfolgreich für das gesunde Blattgewebe anderer Pflanzenarten eingesetzt, sowohl für Monokotylen als auch für Dikotylen, einschließlich Mais (Zea mays), Tomate (Solanum lycopersicum), Liebesgras (Eragrostis nindensis), Purpur-Falschbrome (Brachypodium distachyon) und Wildtabak (Nicotiana benthamiana ; unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus wurde die Isolierungsmethode erfolgreich an die Plastoglobulen von Cyanobakterien, einschließlich Synechocystis sp. PCC 6803 und Anabaena sp. PCC 712015, und das ausgetrocknete Blattgewebe der Auferstehungspflanze, E. nindensis, angepasst.
Chloroplasten-Plastoglobuli von gesundem Blattgewebe sind physikalisch mit den Thylakoidmembranenverbunden 16. Trotz dieser physikalischen Kontinuität behalten die beiden Chloroplasten-Unterkompartimente unterschiedliche Lipid- und Proteinzusammensetzungen bei, obwohl der regulierte Austausch von Lipid und Protein zwischen den beiden Kompartimenten vorgeschlagen wurde 2,4,17,18,19. Tatsächlich wurde kürzlich ein interessantes Hemifusionsmodell für den Transport neutraler Lipide zwischen Chloroplasten und Zytosol19 vorgeschlagen. Aufgrund der physikalischen Kontinuität von Plastoglobuli und Thylakoiden beginnt die Isolationsmethode mit gesundem Blattgewebe mit der Entnahme eines pelletierten rohen Thylakoidpräparats, das anschließend beschallt wird, um die Plastoglobulen von den Thylakoiden zu trennen, was im Gegensatz zu Verfahren zur Isolierung zytosolischer Lipidtröpfchensteht 20 . Die Ultrazentrifugation auf einem Saccharosekissen führt dann die Plastoglobuli niedriger Dichte durch die Saccharose nach oben und trennt sie effektiv von den Thylakoiden, Kernen und anderem Material mit hoher Dichte. Im Gegensatz dazu existieren Plastoglobuli in Cyanobakterien, wie auch solche von ausgetrocknetem Blattgewebe, in vivo offenbar in frei schwebender Form. Daher beinhaltet ihre Isolierung ein direktes Schweben auf einem Saccharosegradienten. Dieser Artikel demonstriert die Isolationsmethode aus gesundem Blattgewebe und demonstriert zwei Variationen, die verwendet werden können, um Plastoglobulen aus ausgetrocknetem Blattgewebe oder Cyanobakterienkulturen zu isolieren, was die physiologische Breite und den evolutionären Kontext, in dem Plastoglobulen untersucht werden können, erheblich erweitert.
Isolierte Plastoglobuli können anschließend für beliebig viele nachgeschaltete Analysen zur Untersuchung molekularer Eigenschaften verwendet werden. Wir haben die isolierten Plastoglobuli aus A. thaliana Blattgewebe für umfangreiche proteomische und lipidomische Analysen unter unterschiedlichen Umweltbedingungen oder Genotypen verwendet, um die selektive Modifikation der Protein- und Lipidzusammensetzung bei der Anpassung an Stresszu demonstrieren 2,4,21,22. Darüber hinaus wurden In-vitro-Kinase-Assays durchgeführt, die eine Transphosphorylierungsaktivität im Zusammenhang mit isolierten Plastoglobulen zeigen 22, die oligomeren Zustände von Proteinkomponenten wurden unter Verwendung der nativen Gelelektrophorese untersucht 21 und Protease-Rasier-Assays durchgeführt 23.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist die relative Geschwindigkeit des Verfahrens. Unserer Erfahrung nach können die unten beschriebenen Protokolle innerhalb von ca. 4 Stunden vollständig abgeschlossen werden. Es wurde eine alternative Methode zur Isolierung von Plastoglobulen aus Blattgewebe beschrieben, die die gleichzeitige Isolierung anderer Chloroplasten-Unterkompartimenteermöglicht 24. Diese alternative Methode bietet einige klare Vorteile, wenn ein quantitativer Vergleich mit den anderen Chloroplasten-Unterkompartimenten notwendig oder erwünscht ist. Diese alternative Methode ist jedoch auch langwieriger und liefert eine deutlich geringere Ausbeute an isolierten Plastoglobulen aus vergleichbaren Mengen an Blattgewebe. Wenn eine fokussierte Untersuchung von Plastoglobuli das Ziel ist, ist die hier skizzierte Methodik die optimale Wahl. Nichtsdestotrotz können während der Probenvorbereitung Gesamtblatt- und rohe Thylakoid-Aliquots gesammelt werden, und es wird dringend empfohlen, dies zu tun, um Referenzproben für den anschließenden Vergleich zu haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um physiologische/biochemische Veränderungen des Materials zu minimieren und bestimmte photo- und thermolabile Prenyl-Lipid-Pigmente zu schützen, die ein reicher Bestandteil von Plastoglobuli sind, ist es wichtig, die Isolierung bei 4 °C und vor Licht geschützt durchzuführen. Wie oben angedeutet, werden die ersten Schritte im Kühlraum unter einer Sicherheitslampe mit einer grün emittierenden Glühbirne durchgeführt. Die weiteren Schritte im Labor erfolgen unter gedimmtem Licht und verwenden Eis oder gekühlte Zen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung in der Lundquist-Laborgruppe wird durch Zuschüsse der NSF (MCB-2034631) und des USDA (MICL08607) an P.K.L. Die Autoren danken Dr. Carrie Hiser (MSU) für die Unterstützung bei der Entwicklung der cyanobakteriellen Plastoglobulen-Isolationsmethode.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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