Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아
Summary
다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.
Abstract
Plastoglobule 지질 방울은 식물 엽록체와 시아 노 박테리아의 동적 하위 구획입니다. 광합성 종들 사이에서 유비쿼터스로 발견되는 그들은 빠르게 변화하는 환경 조건에서 틸라코이드 막의 적응 및 리모델링에 중심적인 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 고순도의 플라스토글로블을 분리할 수 있는 능력은 단백질체, 지질 및 기타 방법론을 통해 연구를 크게 촉진했습니다. 고순도 및 수율의 플라스토글로블을 사용하면 다른 가능한 분자 특성 중에서 지질 및 단백질 조성, 효소 활성 및 단백질 토폴로지를 조사할 수 있습니다. 이 기사는 식물 잎 조직의 엽록체에서 플라스토글로불을 분리하기 위한 신속하고 효과적인 프로토콜을 제시하고 옥수수 잎, 부활 식물의 건조된 잎 조직, Eragrostis nindensis 및 시아노박테리움, Synechocystis 에서 플라스토글로블 및 관련 지질 방울 구조를 분리하기 위한 방법론적 변형을 제시합니다. PCC 6803. 분리는 이러한 지질이 풍부한 입자의 낮은 밀도에 의존하며, 이는 자당 밀도 부유선광에 의한 정제를 용이하게 합니다. 이 방법론은 다양한 종의 플라스토글로블 연구에 가치가 있음이 입증될 것입니다.
Introduction
플라스토글로불 구성 및 기능에 대한 현재의 이해는 상세한 단백질체학 및 지질체 연구 1,2,3,4,5를 통해 나타났습니다. 이러한 연구는 자당 구배를 사용하여 효율적인 분리를 위해 매우 낮은 밀도에 의존하는 신속하고 효과적인 분리 방법에 의해 크게 도움이되었습니다. 너도밤 나무 (Fagus sylvatica), 스카치 빗자루 (Sarothamnus scoparius), 양파 (부추 속 세파), 시금치 (Spinacia oleracea), 팬지 (비올라 삼색), 후추 (고추 일년) 및 완두콩 (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. 엽록체 플라스토글로블을 보다 효율적이고 더 나은 수율 방식으로 분리하는 업데이트된 방법이 나중에 Ytterberg et al.3,14에 의해 제시되었습니다. 처음에는 Arabidopsis thaliana 잎 엽록체의 플라스토글로블 연구에 사용되었지만 옥수수(Zea mays), 토마토(Solanum lycopersicum), 러브그래스(Eragrostis nindensis), 보라색 거짓 브롬(Brachypodium distachyon) 및 야생 담배(Nicotiana benthamiana)를 포함한 다른 식물 종의 건강한 잎 조직에 이 업데이트된 방법을 성공적으로 사용했습니다. ; 미공개 결과). 또한, 분리 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Anabaena sp. PCC 712015를 포함한 시아 노 박테리아의 플라 스토 글로 블과 부활 식물 인 E. nindensis의 건조 된 잎 조직에 성공적으로 적용되었습니다.
건강한 잎 조직의 엽록체 플라스토글로블은 틸라코이드 막(16)에 물리적으로 연결되어 있다. 이러한 물리적 연속성에도 불구하고, 2개의 엽록체 서브-구획은 뚜렷한 지질 및 단백질 조성을 유지하지만, 2개의 구획 사이의 지질과 단백질의 조절된 교환이 제안되었다 2,4,17,18,19. 사실, 흥미로운 반 융합 모델이 최근 엽록체와 세포질19 사이의 중성 지질 밀매에 대해 제안되었습니다. 플라스토글로블과 틸라코이드의 물리적 연속성으로 인해, 건강한 잎 조직을 이용한 분리 방법은 펠렛화된 조잡한 틸라코이드 제제의 수집으로 시작되며, 이어서 초음파 처리되어 플라스토글로블을 틸라코이드로부터 분리하는데, 이는 세포질 지질 방울을 분리하는 데 사용되는 방법과 대조된다20 . 그런 다음 자당 쿠션에서 초원심분리하면 저밀도 플라스토글로블이 자당을 통해 위로 떠올라 틸라코이드, 핵 및 기타 고밀도 물질에서 효과적으로 분리됩니다. 대조적으로, 시아노박테리아의 플라스토글로구와 건조된 잎 조직의 플라스토글로불은 생체 내에서 자유롭게 떠다니는 형태로 존재하는 것 같습니다. 따라서 이들의 격리에는 자당 구배에 직접 떠 있는 것이 포함됩니다. 이 기사는 건강한 잎 조직에서 분리 방법을 보여주고 건조 된 잎 조직 또는 시아 노 박테리아 배양에서 플라 스토 글로 블을 분리하는 데 사용할 수있는 두 가지 변형을 보여 주어 플라 스토 글로 불을 연구 할 수있는 생리 학적 폭과 진화 적 맥락을 크게 확장합니다.
분리된 플라스토글로불은 분자 특성을 조사하기 위해 여러 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 다양한 환경 조건 또는 유전자형에서 광범위한 단백질체 및 지질체 분석을 위해 A. thaliana 잎 조직에서 분리된 플라스토글로불을 사용하여 스트레스 2,4,21,22에 적응하여 단백질 및 지질 조성의 선택적 변형을 입증했습니다. 또한, 단리된 플라스토글로불과의 연관된 트랜스-인산화 활성을 입증하는 시험관내 키나아제 분석이 수행되었고(22), 단백질 성분의 올리고머 상태가 천연 겔 전기영동(21)을 사용하여 조사되었으며, 프로테아제-면도 분석(23)이 수행되었다.
이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도입니다. 경험상 아래에 설명된 프로토콜은 약 4시간 이내에 완전히 완료될 수 있습니다. 잎 조직으로부터 플라스토글로불을 단리하는 대안적인 방법이 설명되었으며, 이는 다른 엽록체 하위구획(24)의 동시 단리를 허용한다. 이 대안적인 방법은 다른 엽록체 하위 구획과의 정량적 비교가 필요하거나 원할 때 몇 가지 분명한 이점을 제공합니다. 그러나,이 대체 방법은 또한 더 지루하며 비슷한 양의 잎 조직으로부터 분리 된 플라스토 글로 블의 수율을 상당히 낮출 것이다. plastoglobules에 대한 집중적 인 연구가 목표 인 경우 여기에 설명 된 방법론이 최적의 선택입니다. 그럼에도 불구하고 샘플 준비 중에 총 잎 및 미정제 틸라코이드 분취량을 수집할 수 있으며 후속 비교를 위해 참조 샘플을 확보하는 것이 좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재료의 생리적/생화학적 변화를 최소화하고 플라스토글로불의 풍부한 성분인 특정 광학적 및 열에 불안정한 프레닐 지질 안료를 보호하려면 4°C에서 분리를 수행하고 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 위에서 지적한 바와 같이, 초기 단계는 녹색 발광 전구를 사용하여 안전 램프 아래의 냉장실에서 수행됩니다. 실험실에서 수행되는 후속 단계는 희미한 조명 아래에서 얼음 또는 냉장 원심 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundquist 실험실 그룹의 연구는 NSF (MCB-2034631) 및 USDA (MICL08607)에서 PKL에 대한 보조금으로 지원됩니다. 저자는 시아노박테리아 플라스토글로불 분리 방법의 개발에 대한 지원에 대해 Dr. Carrie Hiser(MSU)에게 감사를 표합니다.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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