Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias
Summary
Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.
Abstract
As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.
Introduction
A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebola (Allium cepa), espinafre (Spinacia oleracea), pansy (Viola tricolor), pimenta (Capsicum annuum) e ervilha (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Um método atualizado para isolar plastoglóbulos de cloroplasto de forma mais eficiente e melhor produtiva foi posteriormente apresentado por Ytterberg et al.3,14. Embora inicialmente empregado para o estudo dos plastoglóbulos dos cloroplastos foliares de Arabidopsis thaliana, empregamos com sucesso este método atualizado para o tecido foliar saudável de outras espécies vegetais, tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo milho (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), capim-do-amor (Eragrostis nindensis), bromo falso roxo (Brachypodium distachyon) e tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana) ; resultados não publicados). Além disso, o método de isolamento foi adaptado com sucesso aos plastoglóbulos de cianobactérias, incluindo Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e o tecido foliar dessecado da planta da ressurreição, E. nindensis.
Os plastoglóbulos de cloroplasto do tecido foliar saudável estão fisicamente conectados às membranas tilacóides16. Apesar dessa continuidade física, os dois subcompartimentos do cloroplasto mantêm composições lipídicas e proteicas distintas, embora a troca regulada de lipídios e proteínas entre os dois compartimentos tenha sido proposta 2,4,17,18,19. De fato, um interessante modelo de hemifusão foi recentemente proposto para o tráfico de lipídios neutros entre cloroplastos e citosol19. Devido à continuidade física de plastoglobules e tilacóides, o método de isolamento com tecido foliar saudável inicia-se com a coleta de uma preparação tilacóide bruta peletizada, que é posteriormente sonicada para separar os plastoglóbulos dos tilacóides, o que contrasta com os métodos utilizados para isolar gotículas lipídicas citosólicas20 . A ultracentrifugação em uma almofada de sacarose então flutua os plastoglóbulos de baixa densidade através da sacarose, separando-os efetivamente dos tilacóides, núcleos e outros materiais de alta densidade. Em contraste, plastoglóbulos em cianobactérias, bem como os de tecido foliar dessecado, evidentemente existem in vivo em uma forma flutuante. Assim, seu isolamento envolve flutuar diretamente em um gradiente de sacarose. Este artigo demonstra o método de isolamento do tecido foliar saudável e demonstra ainda duas variações que podem ser usadas para isolar plastoglóbulos de tecidos foliares desidratados ou culturas de cianobactérias, expandindo grandemente a amplitude fisiológica e o contexto evolutivo em que os plastoglóbulos podem ser estudados.
Plastoglobules isolados podem posteriormente ser usados para qualquer número de análises a jusante para investigar características moleculares. Utilizamos os plastoglóbulos isolados do tecido foliar de A. thaliana para extensa análise proteômica e lipidômica sob diferentes condições ambientais ou genótipos, demonstrando a modificação seletiva da composição proteica e lipídica em adaptação ao estresse 2,4,21,22. Além disso, ensaios de quinase in vitro que demonstram atividade de transfosforilação associada a plastoglóbulos isolados foram realizados22, os estados oligoméricos de componentes proteicos foram investigados usando eletroforese em gel nativa 21 e ensaios de barbear de protease foram realizados23.
O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento. Em nossa experiência, os protocolos descritos abaixo podem ser totalmente concluídos em aproximadamente 4 h. Um método alternativo para isolar plastoglóbulos do tecido foliar tem sido descrito, o que permite o isolamento simultâneo de outros subcompartimentos de cloroplasto24. Este método alternativo oferece algumas vantagens claras quando a comparação quantitativa com os outros subcompartimentos de cloroplasto é necessária ou desejada. No entanto, este método alternativo também é mais tedioso e proporcionará um rendimento significativamente menor de plastoglóbulos isolados de quantidades comparáveis de tecido foliar. Quando um estudo focado de plastoglobules é o objetivo, a metodologia descrita aqui é a escolha ideal. No entanto, as alíquotas totais foliares e tilacóides brutas podem ser coletadas durante a preparação da amostra, e é altamente recomendável fazê-lo, para ter amostras de referência para posterior comparação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa no grupo de laboratório Lundquist é apoiada por doações da NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) para a P.K.L. Os autores agradecem à Dra. Carrie Hiser (MSU) pelo apoio no desenvolvimento do método de isolamento de plastoglobule cianobacteriano.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
