Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias
Summary
Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.
Abstract
Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.
Introduction
La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scoparius), la cebolla (Allium cepa), la espinaca (Spinacia oleracea), el pensamiento (Viola tricolor), la pimienta (Capsicum annuum) y el guisante (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un método actualizado para aislar plastoglóbulos de cloroplastos de una manera más eficiente y de mejor rendimiento fue presentado posteriormente por Ytterberg et al.3,14. Aunque inicialmente se empleó para el estudio de los plastoglóbulos de los cloroplastos de hojas de Arabidopsis thaliana, hemos empleado con éxito este método actualizado para el tejido foliar sano de otras especies de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo maíz (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), hierba del amor (Eragrostis nindensis), bromo falso púrpura (Brachypodium distachyon) y tabaco silvestre (Nicotiana benthamiana) ; resultados no publicados). Además, el método de aislamiento se ha adaptado con éxito a los plastoglóbulos de cianobacterias, incluyendo Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 712015, y el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, E. nindensis.
Los plastoglóbulos de cloroplasto del tejido foliar sano están conectados físicamente a las membranas tilacoides16. A pesar de esta continuidad física, los dos subcompartimentos del cloroplasto mantienen distintas composiciones de lípidos y proteínas, aunque se ha propuesto el intercambio regulado de lípidos y proteínas entre los dos compartimentos 2,4,17,18,19. De hecho, recientemente se ha propuesto un interesante modelo de hemifusión para el tráfico de lípidos neutros entre cloroplastos y citosol19. Debido a la continuidad física de plastoglóbulos y tilacoides, el método de aislamiento con tejido foliar sano comienza con la recolección de una preparación de tilacoide crudo granulado, que posteriormente se sonica, para separar los plastoglóbulos de los tilacoides, lo que contrasta con los métodos utilizados para aislar gotas lipídicas citosólicas20 . La ultracentrifugación en un cojín de sacarosa hace flotar los plastoglóbulos de baja densidad a través de la sacarosa, separándolos efectivamente de los tilacoides, núcleos y otros materiales de alta densidad. En contraste, los plastoglóbulos en cianobacterias, así como los de tejido foliar desecado, evidentemente existen in vivo en forma flotante. Por lo tanto, su aislamiento implica flotar directamente en un gradiente de sacarosa. Este artículo demuestra el método de aislamiento del tejido foliar sano y además demuestra dos variaciones que se pueden utilizar para aislar plastoglóbulos de tejido foliar desecado o cultivos de cianobacterias, ampliando en gran medida la amplitud fisiológica y el contexto evolutivo en el que se pueden estudiar los plastoglobulos.
Los plastoglóbulos aislados se pueden utilizar posteriormente para cualquier número de análisis posteriores para investigar las características moleculares. Se han utilizado los plastoglobullos aislados del tejido foliar de A. thaliana para un extenso análisis proteómico y lipidómico bajo diferentes condiciones ambientales o genotipos, demostrando la modificación selectiva de la composición proteica y lipídica en adaptación al estrés 2,4,21,22. Además, se han realizado ensayos de quinasa in vitro que demuestran actividad transfosforilación asociada a plastoglóbulos aislados 22, se han investigado los estados oligoméricos de los componentes proteicos mediante electroforesis en gel nativo 21 y se han realizado ensayos de afeitado de proteasa23.
El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento. En nuestra experiencia, los protocolos descritos a continuación se pueden completar completamente en aproximadamente 4 horas. Se ha descrito un método alternativo para aislar plastoglóbulos del tejido foliar, que permite el aislamiento simultáneo de otros subcompartimentos de cloroplastos24. Este método alternativo ofrece algunas ventajas claras cuando es necesaria o deseada una comparación cuantitativa con los otros subcompartimentos del cloroplasto. Sin embargo, este método alternativo también es más tedioso y proporcionará un rendimiento significativamente menor de plastoglóbulos aislados a partir de cantidades comparables de tejido foliar. Cuando el objetivo es un estudio centrado en los plastoglóbulos, la metodología descrita aquí es la opción óptima. No obstante, se pueden recolectar alícuotas totales de hoja y tilacoide crudo durante la preparación de la muestra, y se recomienda encarecidamente hacerlo, para tener muestras de referencia para su posterior comparación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el grupo de laboratorio de Lundquist está respaldada por subvenciones de la NSF (MCB-2034631) y USDA (MICL08607) a P.K.L. Los autores agradecen a la Dra. Carrie Hiser (MSU) por su apoyo en el desarrollo del método de aislamiento de plastoglóbulos cianobacterianos.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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