Plastoglobule lipiddroppisolering från växtbladvävnad och cyanobakterier
Summary
Ett snabbt och effektivt protokoll presenteras för isolering av plastoglobulelipiddroppar associerade med olika fotosyntetiska organismer. Den framgångsrika beredningen av isolerade plastoglobuler är ett avgörande första steg som föregår detaljerade molekylära undersökningar såsom proteomiska och lipidomiska analyser.
Abstract
Plastoglobule lipiddroppar är ett dynamiskt underfack av växtkloroplaster och cyanobakterier. De finns allestädes närvarande bland fotosyntetiska arter och tros tjäna en central roll i anpassningen och ombyggnaden av tylakoidmembranet under snabbt föränderliga miljöförhållanden. Förmågan att isolera plastoglobuler med hög renhet har i hög grad underlättat deras studier genom proteomiska, lipidomiska och andra metoder. Med plastoglobuler med hög renhet och utbyte är det möjligt att undersöka deras lipid- och proteinsammansättning, enzymatisk aktivitet och proteintopologi, bland andra möjliga molekylära egenskaper. Denna artikel presenterar ett snabbt och effektivt protokoll för isolering av plastoglobuler från kloroplaster av växtbladvävnad och presenterar metodologiska variationer för isolering av plastoglobuler och relaterade lipiddroppstrukturer från majsblad, den torkade bladvävnaden i uppståndelseväxten, Eragrostis nindensis och cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering är beroende av den låga densiteten hos dessa lipidrika partiklar, vilket underlättar deras rening genom sackarosdensitetsflotation. Denna metod kommer att visa sig vara värdefull i studien av plastoglobuler från olika arter.
Introduction
Den nuvarande förståelsen av plastoglobulens sammansättning och funktion har framkommit genom detaljerade proteomiska och lipidomiska studier 1,2,3,4,5. Sådana studier har fått stor hjälp av en snabb och effektiv isoleringsmetod som förlitar sig på deras mycket låga densitet för effektiv separation med sackarosgradienter. Initiala metoder för plastoglobuleisolering uppnåddes från arter som bokträdet (Fagus sylvatica), skotsk kvast (Sarothamnus scoparius), lök (Allium cepa), spenat (Spinacia oleracea), pensé (Viola tricolor), peppar (Capsicum annuum) och ärter (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. En uppdaterad metod för att isolera kloroplastplastoglobuler på ett effektivare och bättre avkastande sätt presenterades senare av Ytterberg et al.3,14. Medan vi ursprungligen användes för studier av plastoglobuler av Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi framgångsrikt använt denna uppdaterade metod för frisk bladvävnad från andra växtarter, både monocot och dicot, inklusive majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), lila falsk brom (Brachypodium distachyon) och vild tobak (Nicotiana benthamiana ; opublicerade resultat). Dessutom har isoleringsmetoden framgångsrikt anpassats till plastoglobulerna av cyanobakterier, inklusive Synechocystis sp. PCC 6803 och Anabaena sp. PCC 712015, och den uttorkade bladvävnaden från uppståndelseväxten, E. nindensis.
Kloroplastplastoglobuler av frisk bladvävnad är fysiskt anslutna till tylakoidmembranen16. Trots denna fysiska kontinuitet upprätthåller de två kloroplastunderfacken distinkta lipid- och proteinkompositioner, även om det reglerade utbytet av lipid och protein mellan de två facken har föreslagits 2,4,17,18,19. Faktum är att en intressant hemifusionsmodell nyligen har föreslagits för handel med neutrala lipider mellan kloroplaster och cytosol19. På grund av den fysiska kontinuiteten hos plastoglobuler och tylakoider börjar isoleringsmetoden med frisk bladvävnad med uppsamlingen av ett pelleterat råtylakoidpreparat, som därefter ultraljudas för att separera plastoglobulerna från tylakoiderna, vilket står i kontrast till metoder som används för att isolera cytosoliska lipiddroppar20 . Ultracentrifugering på en sackaroskudde flyter sedan plastoglobulerna med låg densitet upp genom sackarosen och separerar dem effektivt från tylakoiderna, kärnorna och annat material med hög densitet. Däremot finns plastoglobuler i cyanobakterier, liksom de i torkad bladvävnad, uppenbarligen in vivo i en fritt flytande form. Därför innebär deras isolering direkt flytande på en sackarosgradient. Denna artikel visar isoleringsmetoden från frisk bladvävnad och visar vidare två variationer som kan användas för att isolera plastoglobuler från uttorkad bladvävnad eller cyanobakteriella kulturer, vilket kraftigt utökar den fysiologiska bredden och evolutionära sammanhanget där plastoglobuler kan studeras.
Isolerade plastoglobuler kan därefter användas för valfritt antal nedströmsanalyser för att undersöka molekylära egenskaper. Vi har använt de isolerade plastoglobulerna från A. thaliana bladvävnad för omfattande proteomisk och lipidomisk analys under olika miljöförhållanden eller genotyper, vilket visar selektiv modifiering av protein- och lipidkomposition vid anpassning till stress 2,4,21,22. Dessutom har in vitro-kinasanalyser som visar transfosforyleringsaktivitet associerad med isolerade plastoglobuler utförts 22, de oligomera tillstånden för proteinkomponenter har undersökts med användning av inhemsk gelelektrofores 21 och proteas-rakningsanalyser har utförts23.
Den främsta fördelen med denna metod är procedurens relativa hastighet. Enligt vår erfarenhet kan protokollen som beskrivs nedan slutföras helt inom cirka 4 timmar. En alternativ metod för att isolera plastoglobuler från bladvävnad har beskrivits, vilket möjliggör samtidig isolering av andra kloroplastunderfack24. Denna alternativa metod erbjuder några tydliga fördelar när kvantitativ jämförelse med de andra kloroplastunderfacken är nödvändig eller önskad. Denna alternativa metod är emellertid också mer tråkig och kommer att ge ett signifikant lägre utbyte av isolerade plastoglobuler från jämförbara mängder bladvävnad. När en fokuserad studie av plastoglobuler är målet är den metod som beskrivs här det optimala valet. Icke desto mindre kan totala blad- och råtylakoidalikvoter samlas in under provberedningen, och det rekommenderas starkt att göra det för att ha referensprover för efterföljande jämförelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att minimera fysiologiska/biokemiska förändringar i materialet och skydda vissa foto- och termolabila prenyllipidpigment som är en rik komponent i plastoglobuler är det viktigt att utföra isoleringen vid 4 °C och skyddas mot ljus. Som angivits ovan utförs de första stegen i kylrummet under en säkerhetslampa med en grönemitterande glödlampa. De efterföljande stegen som utförs i laboratoriet är under nedtonade ljus och använder is eller kyld centrifugering. Av liknande skäl är införandet av färska p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i Lundquists labbgrupp stöds av anslag från NSF (MCB-2034631) och USDA (MICL08607) till P.K.L. Författarna tackar Dr. Carrie Hiser (MSU) för stöd i utvecklingen av den cyanobakteriella plastoglobuleisoleringsmetoden.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
