微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析
Summary
ここに提示されるのは、 in vitro 好中球細胞外トラップ(NET)の誘導と分析のためのプロトコルです。DNA、カテリシジン(LL37)、および酵素活性の定量により、同様の制御条件下で微生物および化学刺激によって誘導されるNETの組成および形態の変動性を示すデータが得られました。
Abstract
好中球は、好中球細胞外トラップ(NET)の形成など、さまざまなメカニズムを採用することにより、自然免疫応答における細胞防御の第一線として機能します。この研究では、ヒト細胞でのNET誘導と特性評価のための標準化された in vitro 方法論を使用して、微生物および化学的刺激によって誘発されるNETの形態学的および組成的変化を分析します。ここで説明する手順により、NET形態(溶解性または非溶解性)および組成(DNA-タンパク質構造および酵素活性)、およびそのような特性に対する可溶性因子または細胞接触の影響の分析が可能になります。さらに、ここで説明する手法を変更して、NET組成に対する外因性可溶性因子または細胞接触の影響を評価することができます。
適用される技術には、二重密度勾配(1.079-1.098 g / mL)を使用したヒト末梢血からの多形核細胞の精製が含まれ、ライト染色、トリパンブルー排除、およびフローサイトメトリー(FSC対SSC分析および7AAD染色を含む)によって実証されるように、最適な純度と生存率(≥95%)を保証します。NET形成は微生物(緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カン ジダ・アルビカンス)および化学的刺激(ホルボールミリスチン酸酢酸塩、HOCl)刺激によって誘導され、NETはDNA-DAPI染色、抗菌ペプチドカテリシジン(LL37)の免疫染色、および酵素活性の定量(好中球エラスターゼ、カテプシンG、およびミエロペルオキシダーゼ)によって特徴付けられます。画像は蛍光顕微鏡で取得され、ImageJで分析されます。
Introduction
好中球は血流中に最も豊富な白血球であり、DNAといくつかの核、細胞質、および粒状の抗菌タンパク質で構成される大きなクロマチン構造の放出を含む、いくつかのメカニズムによる病原体の除去中に重要な役割を果たします1,2。好中球のこの抗菌的役割を記述する直接の前例は、1996年に武井らによってなされた3。これらの著者らは、好中球のアポトーシスおよびネクロトーシスとは異なる新しい形態の死を報告し、核破裂を示す形態学的変化を示し、その後、核質から細胞質にこぼれ、ホルボールミリスチン酸酢酸塩(PMA)との3時間のインキュベーションから膜透過性の増加を示しました2,3。しかし、「好中球細胞外トラップ(NET)」という用語が使用されたのは2004年のことでした4。
NET形成は、細菌、真菌5、ウイルス6、寄生虫感染などのさまざまな条件で観察されており、微生物の拡散を中和、死滅、および防止します7。他の研究は、サイトカイン、尿酸一ナトリウムまたはコレステロール結晶、自己抗体、免疫複合体、および活性化血小板などの滅菌刺激によって非病原性状態でも起こり得ることを示している7。リポ多糖(LPS)、インターロイキン-8(IL-8)、およびPMAは、NET誘導物質として記載された最初のin vitro刺激の1つであり、病原性プロセスへのin vivoNETの関与は、急性炎症の2つのモデル、実験的赤痢と自然発生性ヒト虫垂炎で実証されました4。DNAは不可欠なNETコンポーネントです。NETとその殺菌特性を分解する短時間のデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)処理によって実証されるように、その適切な構造と組成は、捕獲された微生物に向かって高濃度の抗菌分子を送達することにより、微生物の隔離と死滅に必要です4。DNAに加えて、NETは、ヒストン、好中球エラスターゼ(NE)、カテプシンG(CG)、プロテイナーゼ3、ラクトフェリン、ゼラチナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびカチオン性炎症誘発ペプチドカテリシジンLL-37などの抗菌ペプチド(AMP)などの付着タンパク質を含む8,9。そのような凝集体は、最大50nmの直径を有するより大きな糸を形成し得る。これらの要因は、微生物の病原性因子または病原体細胞膜の完全性を破壊する可能性があります。さらに、AMPは、細菌ヌクレアーゼによる分解に対してNET由来のDNAを安定化させることができる10。
NET形成を制御する具体的なメカニズムはまだ完全には解明されていません。NET放出につながる最も特徴のある経路は、NADPHオキシダーゼの活性化と活性酸素種(ROS)産生につながるERKシグナル伝達、およびMPO経路の活性化を引き起こす細胞内カルシウムの増加によるものです。これにより、過酸化水素が次亜塩素酸に変換され、酸化によってNEが活性化されます11,12。NEは、細胞骨格のアクチンフィラメントを分解して食作用をブロックし、それらを核に移動して、顆粒および細胞質タンパク質と会合し、細胞外に放出されるクロマチン線維の脱感作を促進するPAD4によるタンパク質分解切断および脱アミノ化による処理を行います7。これらのプロテアーゼとしては、アズロフィル顆粒のアズロソーム複合体やカテプシンG13などの他のプロテアーゼから放出されるものが挙げられる。
好中球の形態学的変化に応じて、NETは2つのタイプに分類されます:細胞死につながる自殺または溶解性のNET形成4、および貪食能力を備えた核細胞またはミトコンドリアDNAの小胞放出によって媒介される生存細胞によって生成されるバイタルまたは非溶解性のNET形成14,15。一般に、ミトコンドリアDNAからなるNETは細長い繊維14形態を示し、一方核DNAから構成されたものは雲のような外観3を有する。しかしながら、好中球がそのDNA起源をどのように選択するかは知られていない。NETの標準的な経路が数時間かかると説明していた以前の研究とは対照的に、バイタル経路はわずか5〜60分で急速に活性化されます15。
これらの進歩にもかかわらず、NET組成は刺激によって異なります。例えば、緑膿菌の異なるムコイド株および非ムコイド株は、33個の共通タンパク質および最大50個の可変タンパク質を含むNETの形成を誘導する7。したがって、研究グループで客観的な結論を生み出すことを可能にする技術を均質化する必要があります。本稿では、黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、緑膿菌(グラム陰性菌)、カンジダ・アルビカンス(真菌)、および健常人のヒト好中球の化学刺激(PMA、HOCl)など、さまざまな微生物で誘導されたNETの組成、構造、形態を比較および評価できるさまざまな手法によるプロトコルについて説明します。代表的な結果は、DNA-DAPI染色、LL37の免疫染色、および酵素活性(NE、CG、およびMPO)の定量を特徴とする、同等のin vitro条件下での誘導刺激に依存するNETの不均一性を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
NETの放出を誘導するには、これらの細胞の 生体外 寿命が平均8時間に制限されているため、生存可能な好中球の高純度集団を取得する必要があり、その期間内にすべての実験を実行する必要があります。この目的のために、理想的な方法論は、Ficoll-Histopaque勾配またはデキストラン沈降技術とは対照的に、外因性刺激に対してより応答性の高い非活性化細胞を単離することによって精?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CONACyTからの基礎科学助成金(#285480)と、オアハカ自治大学生化学学部の臨床免疫学研究部門によってサポートされました。A.A.A、S.A.S.L、W.J.R.R.は、それぞれCONACyT番号#799779、#660793、#827788の博士号を取得しています。
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
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