Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET’s geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.
Abstract
Neutrofielen functioneren als de eerste lijn van cellulaire verdediging in een aangeboren immuunrespons door gebruik te maken van verschillende mechanismen, zoals de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s). Deze studie analyseert de morfologische en compositorische veranderingen in NET’s geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli met behulp van gestandaardiseerde in vitro methodologieën voor NET-inductie en karakterisering met menselijke cellen. De hier beschreven procedures maken de analyse van NET-morfologie (lytisch of niet-lytisch) en samenstelling (DNA-eiwitstructuren en enzymatische activiteit) en het effect van oplosbare factoren of cellulair contact op dergelijke kenmerken mogelijk. Bovendien kunnen de hier beschreven technieken worden gewijzigd om het effect van exogene oplosbare factoren of cellulair contact op de NET-samenstelling te evalueren.
De toegepaste technieken omvatten de zuivering van polymorfonucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed met behulp van een gradiënt met dubbele dichtheid (1,079-1,098 g / ml), waardoor optimale zuiverheid en levensvatbaarheid (≥ 95%) worden gegarandeerd, zoals aangetoond door Wright’s kleuring, trypan blue uitsluiting en flowcytometrie, inclusief FSC versus SSC-analyse en 7AAD-kleuring. NET-vorming wordt geïnduceerd met microbiële (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans) en chemische (phorbol myristate acetaat, HOCl) stimuli, en de NET’s worden gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor het antimicrobiële peptide cathelicidin (LL37) en kwantificering van enzymatische activiteit (neutrofiel elastase, cathepsine G en myeloperoxidase). De beelden worden verkregen door fluorescentiemicroscopie en geanalyseerd met ImageJ.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de bloedbaan en spelen een essentiële rol tijdens de klaring van pathogene agentia door verschillende mechanismen, waaronder de afgifte van grote chromatinestructuren bestaande uit DNA en verschillende nucleaire, cytoplasmatische en granulaire antibacteriële eiwitten 1,2. Het directe antecedent dat deze antimicrobiële rol van neutrofielen beschrijft, werd gemaakt door Takei et al.3 in 1996. Deze auteurs rapporteerden een nieuwe vorm van overlijden die verschilt van apoptose en necroptose bij neutrofielen, vertoonden morfologische veranderingen die nucleaire breuk vertoonden, gevolgd door het morsen van het nucleoplasma in het cytoplasma en een toename van de membraanpermeabiliteit vanaf 3 uur incubatie met phorbol myristate acetaat (PMA)2,3. Het was echter pas in 2004 dat de term “neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s)” werd gebruikt4.
NET-vorming is waargenomen in verschillende omstandigheden, zoals bacteriële, schimmel5, virale6 en parasitaire infecties, voor het neutraliseren, doden en voorkomen van microbiële verspreiding7. Andere studies tonen aan dat het ook kan voorkomen in niet-pathogene omstandigheden door steriele stimuli, zoals cytokines, mononatriumurinezuur of cholesterolkristallen, auto-antilichamen, immuuncomplexen en geactiveerde bloedplaatjes7. Lipopolysaccharide (LPS), interleukine-8 (IL-8) en PMA behoorden tot de eerste in vitro stimuli beschreven als NET-inductoren, en de in vivo NET-betrokkenheid bij pathogene processen werd aangetoond in twee modellen van acute ontsteking: experimentele dysenterie en spontane menselijke appendicitis4. DNA is een essentieel NET-onderdeel. De juiste structuur en samenstelling zijn noodzakelijk voor het vastleggen en doden van micro-organismen door een hoge lokale concentratie van antimicrobiële moleculen aan de gevangen microben te leveren, zoals aangetoond door een korte deoxyribonuclease (DNase) behandeling die NET’s en hun microbicide eigenschappen desintegreert4. Naast DNA bestaan NET’s uit aangehechte eiwitten zoals histonen, neutrofiel elastase (NE), cathepsine G (CG), proteïnase 3, lactoferrine, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) en antimicrobiële peptiden (AMPs) zoals het kationische pro-inflammatoire peptide cathelicidin LL-37 onder andere 8,9. Dergelijke aggregaten kunnen grotere draden vormen met diameters tot 50 nm. Deze factoren kunnen de microbiële virulentiefactoren of de integriteit van het pathogene celmembraan verstoren; bovendien kunnen de AMPs het NET-afgeleide DNA stabiliseren tegen afbraak door bacteriële nucleasen10.
De specifieke mechanismen die de netvorming reguleren, zijn nog niet volledig opgehelderd. De best gekarakteriseerde route die leidt tot NET-afgifte is via ERK-signalering, wat leidt tot NADPH-oxidaseactivering en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), evenals verhoogd intracellulair calcium dat activering van de MPO-route veroorzaakt. Dit zet waterstofperoxide op zijn beurt om in hypochloorzuur, waardoor NE wordt geactiveerd door oxidatie11,12. NE is verantwoordelijk voor het afbreken van de actinefilamenten van het cytoskelet om fagocytose te blokkeren en ze naar de kern te transloceren voor verwerking door proteolytische splitsing en deaminering door PAD4 die de desensibilisatie van chromatinevezels aansturen, die associëren met korrel- en cytoplasmatische eiwitten, en vervolgens extracellulair worden vrijgegeven7. Deze proteasen omvatten die welke vrijkomen uit het azurosoomcomplex van de azurofielkorrels en andere proteasen zoals cathepsine G13.
Afhankelijk van de morfologische veranderingen in neutrofielen, worden NET’s ingedeeld in twee typen: suïcidale of lytische NET-vorming die leidt tot celdood4, en vitale of niet-lytische NET-formatie geproduceerd door levensvatbare cellen gemedieerd door een vesiculaire afgifte van nucleair of mitochondriaal DNA, met een overblijfsel van een geanucleeerde cytoplast met fagocytisch vermogen14,15. Over het algemeen vertonen NET’s die zijn samengesteld uit mitochondriaal DNA een langwerpige vezel14 morfologie, terwijl die gestructureerd van nucleair DNA een wolkachtig uiterlijk hebben3. Het is echter niet bekend hoe de neutrofiel zijn DNA-oorsprong kiest. In tegenstelling tot eerdere studies die de canonieke paden van NET’s beschreven als enkele uren nodig, wordt de vitale route snel geactiveerd in slechts 5-60 minuten15.
Ondanks deze vooruitgang varieert de NET-samenstelling afhankelijk van de stimulus; verschillende mucoid en niet-mucoid stammen van P. aeruginosa induceren bijvoorbeeld de vorming van NET’s met 33 gemeenschappelijke eiwitten en maximaal 50 variabele eiwitten7. Het is dus noodzakelijk om technieken te homogeniseren die het genereren van objectieve conclusies in onderzoeksgroepen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft een protocol met verschillende technieken die vergelijking en evaluatie van de samenstelling, structuur en morfologie van NET’s geïnduceerd met verschillende micro-organismen mogelijk maken: Staphylococcus aureus (grampositieve bacterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatieve bacterie) en Candida albicans (schimmel), evenals chemische stimuli (PMA, HOCl) bij menselijke neutrofielen van gezonde individuen. De representatieve resultaten tonen de heterogeniteit van NET’s aan, afhankelijk van hun inducerende stimulus onder vergelijkbare in vitro omstandigheden, gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor LL37 en kwantificering van enzymatische activiteit (NE, CG en MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
Een zeer zuivere populatie van levensvatbare neutrofielen moet worden verkregen om de afgifte van NET’s te induceren, aangezien deze cellen een beperkte ex vivo levensduur hebben van gemiddeld 8 uur, een periode waarbinnen alle experimenten moeten worden uitgevoerd. Hiertoe is de ideale methodologie de gradiënt met dubbele dichtheid om de zuiveringstijd te optimaliseren door niet-geactiveerde cellen te isoleren die beter reageren op exogene stimulatie, in tegenstelling tot Ficoll-Histopaque gradiënt of Dextran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een basisbeurs voor wetenschap (# 285480) van CONACyT en door de afdeling Klinisch Immunologieonderzoek van de faculteit Biochemische Wetenschappen, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L. en W.J.R.R. hebben doctoraatsbeurzen van respectievelijk CONACyT-nummers #799779, #660793 en #827788.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
