माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का रूपात्मक और रचनात्मक विश्लेषण
Summary
यहां प्रस्तुत इन विट्रो न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) के प्रेरण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है। डीएनए, कैथेलिसिडिन (एलएल 37), और एंजाइम गतिविधि का परिमाणीकरण डेटा प्राप्त करता है जो समान नियंत्रित परिस्थितियों में माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी की संरचना और आकृति विज्ञान में परिवर्तनशीलता दिखाता है।
Abstract
न्यूट्रोफिल विभिन्न तंत्रों को नियोजित करके एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सेलुलर रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करते हैं, जैसे कि न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटी) का गठन। यह अध्ययन मानव कोशिकाओं के साथ नेट प्रेरण और लक्षण वर्णन के लिए मानकीकृत इन विट्रो पद्धतियों का उपयोग करके माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित एनईटी में रूपात्मक और रचनात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण करता है। यहां वर्णित प्रक्रियाएं नेट आकृति विज्ञान (लिटिक या गैर-लिटिक) और संरचना (डीएनए-प्रोटीन संरचनाओं और एंजाइमेटिक गतिविधि) के विश्लेषण और ऐसी विशेषताओं पर घुलनशील कारकों या सेलुलर संपर्क के प्रभाव की अनुमति देती हैं। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित तकनीकों को नेट संरचना पर बहिर्जात घुलनशील कारकों या सेलुलर संपर्क के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
लागू तकनीकों में दोहरे घनत्व ढाल (1.079-1.098 ग्राम / एमएल) का उपयोग करके मानव परिधीय रक्त से पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर कोशिकाओं का शुद्धिकरण शामिल है, जो इष्टतम शुद्धता और व्यवहार्यता (≥ 95%) की गारंटी देता है, जैसा कि राइट के धुंधलापन, ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जिसमें एफएससी बनाम एसएससी विश्लेषण और 7 एएडी धुंधलापन शामिल है। नेट गठन माइक्रोबियल (स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, और कैंडिडा अल्बिकन्स) और रासायनिक (फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट, एचओसीएल) उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित होता है, और एनईटी को डीएनए-डीएपीआई धुंधला, रोगाणुरोधी पेप्टाइड कैथेलिसिडिन (एलएल 37) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग, और एंजाइमेटिक गतिविधि (न्यूट्रोफिल इलास्टेस, कैथेप्सिन जी, और मायलोपेरोक्सीडेज) की मात्रा का परिमाणीकरण की विशेषता है। छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और इमेजजे के साथ विश्लेषण किया जाता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल रक्तप्रवाह में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं, जो कई तंत्रों द्वारा रोगजनक एजेंटों की निकासी के दौरान एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें डीएनए और कई परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और दानेदार जीवाणुरोधी प्रोटीनसे बने बड़े क्रोमैटिन संरचनाओं की रिहाई शामिल है। न्यूट्रोफिल की इस रोगाणुरोधी भूमिका का वर्णन करने वाला प्रत्यक्ष पूर्ववर्ती 1996 में टाकेई एट अल.3 द्वारा बनाया गया था। इन लेखकों ने न्यूट्रोफिल में एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस से अलग मृत्यु के एक नए रूप की सूचना दी, परमाणु टूटने का प्रदर्शन करने वाले रूपात्मक परिवर्तन दिखाए, इसके बाद न्यूक्लियोप्लाज्म से साइटोप्लाज्म में फैल गया, और फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) 2,3 के साथ इनक्यूबेशन के 3 घंटे से झिल्ली पारगम्यता में वृद्धि हुई। हालांकि, यह 2004 तक नहीं था कि “न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी)”शब्द का उपयोग किया गया था।
माइक्रोबियल प्रसार को बेअसर करने, मारने और रोकने के लिए विभिन्न स्थितियों, जैसे बैक्टीरियल, फंगल5, वायरल6 और परजीवी संक्रमण में नेट गठन देखा गयाहै। अन्य अध्ययनों से पता चलता है कि यह गैर-रोगजनक स्थितियों में बाँझ उत्तेजनाओं, जैसे साइटोकिन्स, मोनोसोडियम यूरिक एसिड या कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल, ऑटोएंटीबॉडी, प्रतिरक्षा परिसर और सक्रिय प्लेटलेट्स 7 द्वारा भी होसकता है। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8), और पीएमए एनईटी इंड्यूसर के रूप में वर्णित पहले इन विट्रो उत्तेजनाओं में से थे, और रोगजनक प्रक्रियाओं में विवो नेट की भागीदारी तीव्र सूजन के दो मॉडलों में प्रदर्शित की गई थी: प्रयोगात्मक पेचिश और सहज मानव एपेंडिसाइटिस4। डीएनए एक आवश्यक नेट घटक है। पकड़े गए रोगाणुओं की ओर रोगाणुरोधी अणुओं की उच्च स्थानीय एकाग्रता प्रदान करके सूक्ष्मजीवों के पृथक्करण और हत्या के लिए इसकी उपयुक्त संरचना और संरचना आवश्यक है, जैसा कि एक संक्षिप्त डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज़ (डीनेस) उपचार द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो एनईटी और उनके माइक्रोबिसाइडल गुणोंको विघटित करता है। डीएनए के अलावा, एनईटी में हिस्टोन, न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), कैथेप्सिन जी (सीजी), प्रोटीनेज 3, लैक्टोफेरिन, जिलेटिनेस, मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स (एएमपी) जैसे संलग्न प्रोटीन शामिलहैं। इस तरह के समुच्चय 50 एनएम तक व्यास के साथ बड़े धागे बना सकते हैं। ये कारक माइक्रोबियल विषाणु कारकों या रोगज़नक़ कोशिका झिल्ली की अखंडता को बाधित कर सकते हैं; इसके अतिरिक्त, एएमपी बैक्टीरिया न्यूक्लियस10 द्वारा गिरावट के खिलाफ नेट-व्युत्पन्न डीएनए को स्थिर कर सकते हैं।
नेट गठन को विनियमित करने वाले विशिष्ट तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किए गए हैं। नेट रिलीज के लिए सबसे अच्छी विशेषता वाला मार्ग ईआरके सिग्नलिंग के माध्यम से है, जो एनएडीपीएच ऑक्सीडेज सक्रियण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन की ओर जाता है, साथ ही इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में वृद्धि होती है जो एमपीओ मार्ग के सक्रियण को ट्रिगर करती है। यह बदले में हाइड्रोजन पेरोक्साइड को हाइपोक्लोरस एसिड में बदल देता है, ऑक्सीकरण11,12 द्वारा एनई को सक्रिय करता है। एनई साइटोस्केलेटन के एक्टिन फिलामेंट्स को फागोसाइटोसिस को अवरुद्ध करने और पीएडी 4 द्वारा प्रोटियोलिटिक दरार और डीमिनेशन द्वारा प्रसंस्करण के लिए नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए जिम्मेदार है जो क्रोमैटिन फाइबर के डिसेन्सिटाइजेशन को चलाते हैं, जो ग्रेन्युल और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के साथ जुड़ते हैं, और फिरबाह्य रूप से जारी किए जाते हैं। इन प्रोटीज में एज़ुरोफिल ग्रैन्यूल्स और कैथेप्सिन जी13 जैसे अन्य प्रोटीज के अज़ुरोसोम कॉम्प्लेक्स से जारी किए गए शामिल हैं।
न्यूट्रोफिल में रूपात्मक परिवर्तनों के आधार पर, एनईटी को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: आत्मघाती या लिटिक नेट गठन जिससे कोशिका मृत्युहोती है 4, और परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की वेसिकुलर रिलीज द्वारा मध्यस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा निर्मित महत्वपूर्ण या गैर-लिटिक नेट गठन, जिसमें फागोसाइटिक क्षमता14,15 के साथ एक एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट का अवशेष होता है। आम तौर पर, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए से बने एनईटी एक लम्बी फाइबर14 आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं, जबकि परमाणु डीएनए से संरचित लोगों में बादल जैसी उपस्थितिहोती है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि न्यूट्रोफिल अपने डीएनए मूल को कैसे चुनता है। पिछले अध्ययनों के विपरीत जो एनईटी के कैननिकल मार्गों को कई घंटों की आवश्यकता के रूप में वर्णित करते हैं, महत्वपूर्ण मार्ग केवल 5-60 मिनट15 में तेजी से सक्रिय होता है।
इन प्रगति के बावजूद, एनईटी संरचना उत्तेजना के आधार पर भिन्न होती है; उदाहरण के लिए, पी एरुगिनोसा के विभिन्न श्लेष्म और गैर-श्लेष्म उपभेद 33 सामान्य प्रोटीन और 50 चर प्रोटीन युक्त एनईटी के गठन को प्रेरित करतेहैं। इस प्रकार, उन तकनीकों को समरूप करना आवश्यक है जो अनुसंधान समूहों में उद्देश्य निष्कर्षों की पीढ़ी की अनुमति देते हैं। यह पेपर विभिन्न तकनीकों के साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो विभिन्न सूक्ष्मजीवों के साथ प्रेरित एनईटी की संरचना, संरचना और आकृति विज्ञान की तुलना और मूल्यांकन की अनुमति देता है: स्टेफिलोकोकस ऑरियस (ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु), स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (ग्राम-नकारात्मक जीवाणु), और कैंडिडा अल्बिकन्स (कवक), साथ ही स्वस्थ व्यक्तियों से मानव न्यूट्रोफिल में रासायनिक उत्तेजना (पीएमए, एचओसीएल)। प्रतिनिधि परिणाम तुलनात्मक इन विट्रो स्थितियों के तहत उनके उत्प्रेरण उत्तेजना के आधार पर एनईटी की विविधता को प्रदर्शित करते हैं, जो डीएनए-डीएपीआई धुंधलापन, एलएल 37 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग और एंजाइमेटिक गतिविधि (एनई, सीजी और एमपीओ) की मात्रा का निर्धारण करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एनईटी की रिहाई को प्रेरित करने के लिए व्यवहार्य न्यूट्रोफिल की एक अत्यधिक शुद्ध आबादी प्राप्त की जानी चाहिए क्योंकि इन कोशिकाओं में औसतन 8 घंटे का सीमित पूर्व विवो जीवनकाल होता है, एक अवधि जिसके भी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कोनासाइट से एक बुनियादी विज्ञान अनुदान (# 285480) और जैव रासायनिक विज्ञान संकाय के क्लिनिकल इम्यूनोलॉजी रिसर्च विभाग द्वारा समर्थित किया गया था। ए.ए.ए., एस.ए.एस.एल. और डब्ल्यू.जे.आर.आर. के पास क्रमशः कोनासाइट नंबर # 799779, # 660793 और # 827788 की डॉक्टरेट फैलोशिप है।
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
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