미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석
Summary
여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.
Abstract
호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NET) 형성과 같은 다양한 메커니즘을 사용하여 선천성 면역 반응에서 세포 방어의 첫 번째 라인으로 기능합니다. 이 연구는 인간 세포를 사용한 NET 유도 및 특성화를 위한 표준화된 시험관 내 방법론을 사용하여 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 형태학적 및 조성적 변화를 분석합니다. 여기에 설명된 절차를 통해 NET 형태(용균 또는 비용균) 및 조성(DNA-단백질 구조 및 효소 활성)을 분석하고 이러한 특성에 대한 가용성 인자 또는 세포 접촉의 영향을 분석할 수 있습니다. 부가적으로, 여기에 기술된 기술은 NET 조성물에 대한 외인성 가용성 인자 또는 세포 접촉의 효과를 평가하기 위해 변형될 수 있다.
응용 기술에는 이중 밀도 구배(1.079-1.098g/mL)를 사용하여 인간 말초 혈액에서 다형핵 세포를 정제하는 것이 포함되며, Wright의 염색, 트립판 블루 배제 및 FSC 대 SSC 분석 및 7AAD 염색을 포함한 유세포분석에서 입증된 최적의 순도와 생존력(≥ 95%)을 보장합니다. NET 형성은 미생물 (녹농균, 황색 포도상 구균 및 칸 디다 알비 칸스) 및 화학적 (포볼 미리 스테이트 아세테이트, HOCl) 자극으로 유도되며, NETs는 DNA-DAPI 염색, 항균 펩티드 카텔리시딘 (LL37)에 대한 면역 염색 및 효소 활성의 정량화 (호중구 엘라스타제, 카텝신 G 및 미엘로 퍼 옥시다제)를 특징으로합니다. 이미지는 형광 현미경을 통해 획득되고 ImageJ로 분석됩니다.
Introduction
호중구는 혈류에서 가장 풍부한 백혈구로, DNA와 여러 핵, 세포질 및 과립 항균 단백질로 구성된 큰 염색질 구조의 방출을 포함하여 여러 메커니즘에 의해 병원성 물질을 제거하는 동안 필수적인 역할을 합니다1,2. 호중구의 이러한 항균 역할을 설명하는 직접적인 선행은 1996 년 Takei et al.3에 의해 만들어졌습니다. 이 저자들은 호중구의 세포 사멸 및 괴사와는 다른 새로운 형태의 사망을보고했으며, 핵 파열을 나타내는 형태 학적 변화를 보인 후 핵질에서 세포질로 유출되고 포볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)로 배양 3 시간에서 막 투과성이 증가했다고보고했습니다.2,3. 그러나 2004 년이 되어서야 “호중구 세포 외 트랩 (NET)”이라는 용어가 사용되었습니다4.
NET 형성은 박테리아, 곰팡이5, 바이러스6 및 기생충 감염과 같은 다양한 조건에서 미생물 전파를 중화, 사멸 및 방지하기 위해관찰되었습니다7. 다른 연구에 따르면 사이토 카인, 요산 나트륨 또는 콜레스테롤 결정,자가 항체, 면역 복합체 및 활성화 된 혈소판과 같은 멸균 자극에 의해 비 병원성 조건에서도 발생할 수 있습니다7. 지질 다당류 (LPS), 인터루킨 -8 (IL-8) 및 PMA는 NET 유도제로 기술 된 최초의 시험관 내 자극 중 하나였으며, 병원성 과정에서의 생체 내 NET 관여는 급성 염증의 두 가지 모델에서 입증되었습니다 : 실험적 이질 및 자발적인 인간 맹장염4. DNA는 필수적인 NET 구성 요소입니다. NETs 및 그살균 특성을 분해하는 간단한 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 처리에 의해 입증된 바와 같이, 포획된 미생물을 향해 높은 국소 농도의 항균 분자를 전달함으로써 미생물의 격리 및 사멸에 적절한 구조 및 조성이 필요합니다4. DNA 외에도 NET은 히스톤, 호중구 엘라스타제(NE), 카텝신 G(CG), 프로테이나제 3, 락토페린, 젤라티나제, 미엘로퍼옥시다제(MPO) 및 양이온성 전염증성 펩타이드 카텔리시딘 LL-37과 같은 항균 펩타이드(AMP)와 같은 부착 단백질로 구성됩니다. 이러한 응집체는 직경이 최대 50 nm 인 더 큰 나사를 형성 할 수 있습니다. 이러한 요인은 미생물 독성 인자 또는 병원체 세포막의 완전성을 파괴 할 수 있습니다. 추가적으로, AMP는 박테리아 뉴클레아제(10)에 의한 분해에 대해 NET-유래 DNA를 안정화시킬 수 있다.
NET 형성을 조절하는 특정 메커니즘은 아직 완전히 명확하지 않습니다. NET 방출로 이어지는 가장 잘 특성화된 경로는 NADPH 산화효소 활성화 및 활성 산소 종(ROS) 생성뿐만 아니라 MPO 경로의 활성화를 유발하는 세포 내 칼슘 증가로 이어지는 ERK 신호 전달을 통한 것입니다. 이것은 차례로 과산화수소를 차아염소산으로 변환하여 산화11,12에 의해 NE를 활성화시킵니다. NE는 세포 골격의 액틴 필라멘트를 분해하여 식균 작용을 차단하고 과립 및 세포질 단백질과 결합하는 염색질 섬유의 탈감작을 유도하는 PAD4에 의한 단백질 분해 절단 및 탈 아미노에 의한 처리를 위해 핵으로 전위시킨 다음 세포 외로 방출됩니다7. 이들 프로테아제는 아주로필 과립 및 다른 프로테아제, 예컨대 카텝신 G13의 아주로좀 복합체로부터 방출된 것을 포함한다.
호중구의 형태 학적 변화에 따라 NET은 세포 사멸을 유도하는 자살 또는 용해성 NET 형성4과 핵 또는 미토콘드리아 DNA의 소포 방출에 의해 매개되는 생존 세포에 의해 생성 된 필수 또는 비 용해성 NET 형성의 두 가지 유형으로 분류됩니다14,15. 일반적으로, 미토콘드리아 DNA로 구성된 NET은 길쭉한 섬유14 형태를 나타내는 반면, 핵 DNA로 구성된 NET은 구름과같은 외관3을 갖는다. 그러나 호중구가 DNA 기원을 선택하는 방법은 알려져 있지 않습니다. NET의 표준 경로가 몇 시간이 필요하다고 설명한 이전 연구와 달리 중요한 경로는 단 5-60분 만에 빠르게 활성화됩니다15.
이러한 발전에도 불구하고 NET 구성은 자극에 따라 다릅니다. 예를 들어, 녹농균의 상이한 점액질 및 비 점액 균주는 33 개의 공통 단백질과 최대 50 개의 가변 단백질7을 포함하는 NET의 형성을 유도합니다. 따라서 연구 그룹에서 객관적인 결론을 도출 할 수있는 기술을 균질화해야합니다. 이 논문은 황색포도상구균(그람 양성균), 녹농균(그람 음성 박테리아), 칸디다 알비칸스(곰팡이)와 같은 다양한 미생물로 유도된 NET의 구성, 구조 및 형태를 비교하고 평가할 수 있는 다양한 기술을 사용한 프로토콜과 건강한 개인의 인간 호중구에 대한 화학적 자극(PMA, HOCl)을 설명합니다. 대표적인 결과는 DNA-DAPI 염색, LL37에 대한 면역염색 및 효소 활성(NE, CG 및 MPO)의 정량화를 특징으로 하는 유사한 시험관 내 조건에서 유도 자극에 따라 NET의 이질성을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET의 방출을 유도하기 위해서는 매우 순수한 생존 가능한 호중구 집단을 얻어야 하는데, 이는 이러한 세포가 모든 실험을 수행해야 하는 기간인 평균 8시간의 제한된 생체외 수명을 갖기 때문입니다. 이를 위해, 이상적인 방법론은 Ficoll-Histopaque 구배 또는 덱스트란 침강 기술(17)과 대조적으로, 외인성 자극에 더 반응하는 비활성화된 세포를 단리함으로써 정제 시간을 최적…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 CONACyT의 기초 과학 보조금 (# 285480)과 오악 사카 대학교 생화학 과학 학부의 임상 면역학 연구과, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’de Oaxaca의 지원을 받았습니다. A.A.A, S.A.S.L 및 W.J.R.R.은 각각 CONACyT 번호 #799779, #660793 및 #827788의 박사 펠로우십을 보유하고 있습니다.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
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