Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями
Summary
Здесь представлен протокол индукции и анализа внеклеточных ловушек нейтрофилов in vitro (NETs). Количественная оценка ДНК, кателицидина (LL37) и активности ферментов дала данные, которые показывают изменчивость состава и морфологии NETs, индуцированных микробными и химическими стимулами в аналогичных контролируемых условиях.
Abstract
Нейтрофилы функционируют как первая линия клеточной защиты во врожденном иммунном ответе, используя различные механизмы, такие как формирование внеклеточных ловушек нейтрофилов (NETs). В этом исследовании анализируются морфологические и композиционные изменения в НЭТ, индуцированные микробными и химическими стимулами, с использованием стандартизированных методологий in vitro для индукции и характеристики NET с клетками человека. Описанные здесь процедуры позволяют проанализировать морфологию NET (литическую или нелитическую) и состав (ДНК-белковые структуры и ферментативную активность), а также влияние растворимых факторов или клеточного контакта на такие характеристики. Кроме того, методы, описанные здесь, могут быть модифицированы для оценки влияния экзогенных растворимых факторов или клеточного контакта на композицию NET.
Применяемые методы включают очистку полиморфноядерных клеток из периферической крови человека с использованием градиента двойной плотности (1,079-1,098 г / мл), гарантируя оптимальную чистоту и жизнеспособность (≥ 95%), что продемонстрировано окрашиванием Райта, исключением трипан-синего и проточной цитометрией, включая анализ FSC против SSC и окрашивание 7AAD. Образование NET индуцируется микробными (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Candida albicans) и химическими (форбол миристата ацетат, HOCl) стимулами, а NETs характеризуются окрашиванием ДНК-DAPI, иммуноокрашиванием антимикробного пептида кателицидина (LL37) и количественной оценкой ферментативной активности (нейтрофильная эластаза, катепсин G и миелопероксидаза). Изображения получены с помощью флуоресцентной микроскопии и проанализированы с помощью ImageJ.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в кровотоке, играя существенную роль во время клиренса патогенных агентов несколькими механизмами, включая высвобождение крупных структур хроматина, состоящих из ДНК и нескольких ядерных, цитоплазматических и зернистых антибактериальных белков 1,2. Прямой предшественник, описывающий эту антимикробную роль нейтрофилов, был сделан Takei et al.3 в 1996 году. Эти авторы сообщили о новой форме смерти, отличной от апоптоза и некроптоза у нейтрофилов, показали морфологические изменения, демонстрирующие ядерный разрыв с последующим выплескиванием из нуклеоплазмы в цитоплазму и увеличением проницаемости мембраны от 3 ч инкубации с форбол миристатом ацетатом (PMA)2,3. Однако только в 2004 году был использован термин «внеклеточные ловушки нейтрофилов (NETs)»4.
Образование NET наблюдалось в различных условиях, таких как бактериальные, грибковые5, вирусные6 и паразитарные инфекции, для нейтрализации, уничтожения и предотвращения распространения микробов7. Другие исследования показывают, что он также может возникать в непатогенных условиях стерильными стимулами, такими как цитокины, мононатриевая мочевая кислота или кристаллы холестерина, аутоантитела, иммунные комплексы и активированные тромбоциты7. Липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-8 (IL-8) и ПМА были одними из первых стимулов in vitro, описанных как индукторы NET, а участие IN VIVO NET в патогенных процессах было продемонстрировано в двух моделях острого воспаления: экспериментальной дизентерии и спонтанного аппендицита человека4. ДНК является важным компонентом NET. Его соответствующая структура и состав необходимы для связывания и уничтожения микроорганизмов путем доставки высокой локальной концентрации антимикробных молекул к пойманным микробам, о чем свидетельствует кратковременная обработка дезоксирибонуклеазой (ДНКаза), которая разрушает НЭТ и их микробицидные свойства4. Помимо ДНК, NETs содержат присоединенные белки, такие как гистоны, нейтрофильная эластаза (NE), катепсин G (CG), протеиназа 3, лактоферрин, желатиназа, миелопероксидаза (MPO) и антимикробные пептиды (AMPs), такие как катионный провоспалительный пептидный кателицидин LL-37 среди других 8,9. Такие агрегаты могут образовывать более крупные нити диаметром до 50 нм. Эти факторы могут нарушать микробные факторы вирулентности или целостность клеточной мембраны патогена; кроме того, AMP могут стабилизировать ПОЛУЧЕННУЮ ИЗ NET ДНК против деградации бактериальными нуклеазами10.
Конкретные механизмы, регулирующие образование NET, до сих пор полностью не выяснены. Наиболее характеризуемым путем, ведущим к высвобождению NET, является передача сигналов ERK, которая приводит к активации NADPH-оксидазы и производству активных форм кислорода (АФК), а также к увеличению внутриклеточного кальция, который вызывает активацию пути MPO. Это, в свою очередь, превращает перекись водорода в хлорноватистую кислоту, активируя NE путем окисления11,12. NE отвечает за деградацию актиновых нитей цитоскелета для блокирования фагоцитоза и перемещения их в ядро для обработки протеолитическим расщеплением и дезаминированием PAD4, которые управляют десенсибилизацией хроматиновых волокон, которые связываются с гранулами и цитоплазматическими белками, а затем высвобождаются внеклеточнымобразом 7. Эти протеазы включают те, которые высвобождаются из азуросомного комплекса гранул азурофилов и других протеаз, таких как катепсин G13.
В зависимости от морфологических изменений нейтрофилов, НЭТ классифицируются на два типа: суицидальное или литическое образование NET, приводящее к гибели клеток4, и жизненно важное или нелитическое ОБРАЗОВАНИЕ NET, продуцируемое жизнеспособными клетками, опосредованными везикулярным высвобождением ядерной или митохондриальной ДНК, с остатком ануклеированного цитопласта с фагоцитарной способностью14,15. Как правило, НЭТ, состоящие из митохондриальной ДНК, имеют удлиненную морфологию волокна14, в то время как те, которые структурированы из ядерной ДНК, имеют облачный вид3. Однако неизвестно, как нейтрофил выбирает свое ДНК-происхождение. В отличие от предыдущих исследований, которые описывали канонические пути НЭТ как требующие нескольких часов, жизненно важный путь быстро активируется всего за 5-60 минут15.
Несмотря на эти достижения, состав NET варьируется в зависимости от стимула; например, различные мукоидные и немукоидные штаммы P. aeruginosa индуцируют образование NETs, содержащих 33 общих белка и до 50 переменных белков7. Таким образом, необходимо гомогенизировать методики, позволяющие формировать объективные выводы в исследовательских группах. В данной работе описан протокол с различными методами, позволяющими сравнивать и оценивать состав, структуру и морфологию НЭТ, индуцированных различными микроорганизмами: золотистым стафилококком (грамположительная бактерия), Pseudomonas aeruginosa (грамотрицательная бактерия) и Candida albicans (гриб), а также химическими стимулами (PMA, HOCl) в нейтрофилах человека от здоровых людей. Репрезентативные результаты демонстрируют гетерогенность НЭТ в зависимости от их индуцирующего стимула в сопоставимых условиях in vitro, характеризующихся окрашиванием ДНК-DAPI, иммуноокрашиванием для LL37 и количественной оценкой ферментативной активности (NE, CG и MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
Высокочистая популяция жизнеспособных нейтрофилов должна быть получена, чтобы индуцировать высвобождение НЭТ, поскольку эти клетки имеют ограниченное время жизни ex vivo в среднем 8 ч, период, в течение которого должны быть выполнены все эксперименты. С этой целью идеальной методоло…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом фундаментальной науки (#285480) от CONACyT и Департаментом клинических иммунологических исследований факультета биохимических наук Автономного университета «Бенито Хуарес» де Оахака. A.A.A, S.A.S.L и W.J.R.R. имеют докторские стипендии номеров CONACyT #799779, #660793 и #827788 соответственно.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
