Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Abstract

Los neutrófilos funcionan como la primera línea de defensa celular en una respuesta inmune innata mediante el empleo de diversos mecanismos, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). Este estudio analiza los cambios morfológicos y de composición en los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos utilizando metodologías estandarizadas in vitro para la inducción y caracterización de NET con células humanas. Los procedimientos descritos aquí permiten el análisis de la morfología NET (lítica o no lítica) y la composición (estructuras ADN-proteína y actividad enzimática), y el efecto de los factores solubles o el contacto celular sobre dichas características. Además, las técnicas descritas aquí podrían modificarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular en la composición de NET.

Las técnicas aplicadas incluyen la purificación de células polimorfonucleares de sangre periférica humana utilizando un gradiente de doble densidad (1.079-1.098 g/mL), garantizando una pureza y viabilidad óptimas (≥ 95%) como lo demuestra la tinción de Wright, la exclusión de azul de tripano y la citometría de flujo, incluido el análisis FSC versus SSC y la tinción 7AAD. La formación de NET se induce con estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans) y químicos (acetato de forbol miristato, HOCl), y los NET se caracterizan por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para el péptido antimicrobiano catelicidina (LL37) y cuantificación de la actividad enzimática (elastasa de neutrófilos, catepsina G y mieloperoxidasa). Las imágenes se adquieren a través de microscopía de fluorescencia y se analizan con ImageJ.

Introduction

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en el torrente sanguíneo, desempeñando un papel esencial durante la eliminación de agentes patógenos por varios mecanismos, incluyendo la liberación de grandes estructuras de cromatina compuestas de ADN y varias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas y granulares ^1,2. El antecedente directo que describe este papel antimicrobiano de los neutrófilos fue elaborado por Takei et ^al.3 en 1996. Estos autores relataron una nueva forma de muerte diferente de la apoptosis y necroptosis en neutrófilos, mostraron cambios morfológicos que exhibieron ruptura nuclear, seguido de derrame del nucleoplasma hacia el citoplasma, y un aumento en la permeabilidad de la membrana a partir de 3 h de incubación con acetato de forbol miristato (PMA)^2,3. Sin embargo, no fue hasta 2004 que se utilizó el término “trampas extracelulares de neutrófilos (TNE)”⁴.

Se ha observado la formación de NET en diversas afecciones, como infecciones bacterianas, fúngicas⁵,^{virales 6} y parasitarias, para neutralizar, matar y prevenir la diseminación microbiana⁷. Otros estudios muestran que también puede ocurrir en condiciones no patógenas por estímulos estériles, como citoquinas, ácido úrico monosódico o cristales de colesterol, autoanticuerpos, complejos inmunes y plaquetas activadas⁷. El lipopolisacárido (LPS), la interleucina-8 (IL-8) y el PMA estuvieron entre los primeros estímulos in vitro descritos como inductores de NET, y la participación in vivo de NET en procesos patogénicos se demostró en dos modelos de inflamación aguda: disentería experimental y apendicitis humana espontánea⁴. El ADN es un componente NET esencial. Su estructura y composición apropiadas son necesarias para el secuestro y la muerte de microorganismos mediante la entrega de una alta concentración local de moléculas antimicrobianas hacia los microbios capturados, como lo demuestra un breve tratamiento con desoxirribonucleasa (DNasa) que desintegra los NET y sus propiedades microbicidas⁴. Además del ADN, los NET comprenden proteínas unidas como histonas, elastasa de neutrófilos (NE), catepsina G (CG), proteinasa 3, lactoferrina, gelatinasa, mieloperoxidasa (MPO) y péptidos antimicrobianos (AMP) como el péptido proinflamatorio catiónico catelicidina LL-37 entre otros ^8,9. Tales agregados pueden formar hilos más grandes con diámetros de hasta 50 nm. Estos factores pueden alterar los factores de virulencia microbiana o la integridad de la membrana celular patógena; además, los AMPs pueden estabilizar el ADN derivado de NET contra la degradación por nucleasas bacterianas¹⁰.

Los mecanismos específicos que regulan la formación de NET aún no se han aclarado completamente. La vía mejor caracterizada que conduce a la liberación de NET es a través de la señalización ERK, que conduce a la activación de la NADPH oxidasa y a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como al aumento del calcio intracelular que desencadena la activación de la vía MPO. Esto a su vez transforma el peróxido de hidrógeno en ácido hipocloroso, activando NE por oxidación^11,12. NE es responsable de degradar los filamentos de actina del citoesqueleto para bloquear la fagocitosis y translocarlos al núcleo para su procesamiento por escisión proteolítica y desaminación por PAD4 que impulsan la desensibilización de las fibras de cromatina, que se asocian con proteínas granulares y citoplasmáticas, y luego se liberan extracelularmente⁷. Estas proteasas incluyen las liberadas por el complejo azurosómico de los gránulos azurófilos y otras proteasas como la catepsina G¹³.

Dependiendo de los cambios morfológicos en los neutrófilos, los TNE se clasifican en dos tipos: formación de NET suicida o lítica que conduce a la muerte celular⁴, y formación de NET vital o no lítica producida por células viables mediadas por una liberación vesicular de ADN nuclear o mitocondrial, con un remanente de un citoplasto anucleado con capacidad fagocítica^14,15. Generalmente, los NET compuestos de ADN mitocondrial presentan una morfología de fibra alargada¹⁴, mientras que los estructurados de ADN nuclear tienen una apariencia de nube³. Sin embargo, no se sabe cómo el neutrófilo elige su origen de ADN. Contrariamente a estudios previos que describieron las vías canónicas de los NET como que requieren varias horas, la vía vital se activa rápidamente en solo 5-60 min¹⁵.

A pesar de estos avances, la composición NET varía dependiendo del estímulo; por ejemplo, diferentes cepas mucoides y no mucoides de P. aeruginosa inducen la formación de NET que contienen 33 proteínas comunes y hasta 50 proteínas variables⁷. Así, es necesario homogeneizar técnicas que permitan la generación de conclusiones objetivas en los grupos de investigación. Este artículo describe un protocolo con diversas técnicas que permiten comparar y evaluar la composición, estructura y morfología de los TNE inducidos con diferentes microorganismos: Staphylococcus aureus (bacteria grampositiva), Pseudomonas aeruginosa (bacteria gramnegativa) y Candida albicans (hongo), así como estímulos químicos (PMA, HOCl) en neutrófilos humanos de individuos sanos. Los resultados representativos demuestran la heterogeneidad de los TNE dependiendo de su estímulo inductor en condiciones in vitro comparables, caracterizadas por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para LL37 y cuantificación de la actividad enzimática (NE, CG y MPO).

Protocol

Las muestras de sangre se obtuvieron como donaciones de participantes clínicamente sanos después del consentimiento informado. Todos los experimentos se realizaron con el permiso del Comité de Ética en Investigación Humana de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. NOTA: Los criterios de inclusión en el estudio fueron sexo y edad indistintos, y clínicamente sanos de acuerdo con las respuestas de los participantes a un cuestionario ant…

Representative Results

Pureza y viabilidad de los neutrófilosLas fases celulares dinámicas se visualizan en el tubo a partir de la purificación de gradiente de doble densidad. Dentro de estas capas, la capa correspondiente a los granulocitos está por encima de la capa de densidad de 1,079 g/ml, que se distingue de las fases de los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) y eritrocitos (Figura 1A). La morfología de las células purificadas se verificó con la tinción de Wright mediant…

Discussion

Se debe obtener una población altamente pura de neutrófilos viables para inducir la liberación de TNE, ya que estas células tienen una vida útil ex vivo limitada de 8 h en promedio, un período dentro del cual se deben realizar todos los experimentos. Para ello, la metodología ideal es el gradiente de doble densidad para optimizar el tiempo de purificación mediante el aislamiento de células no activadas más sensibles a la estimulación exógena, en contraste con el gradiente de Ficoll-Histopaque o las t…

Materials

24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL – Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory – CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML