본 프로토콜은 상부 경추 신경절을 식별하고 절제함으로써 아드레날린성 신경 분포를 절제하는 마우스 모델을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
교감 신경계가 암 진행에 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있습니다. 아드레날린성 신경 분포는 침샘 분비, 일주기 리듬, 황반 변성, 면역 기능 및 심장 생리학을 조절합니다. 쥐 외과적 교감신경 절제술은 반복적인 약리학적 개입 및 관련 부작용의 필요성을 피하면서 완전하고 일방적인 아드레날린 절제를 허용함으로써 아드레날린 신경 분포의 효과를 연구하는 방법입니다. 그러나 생쥐의 외과적 교감신경 절제술은 상부 경추 신경절의 크기가 작기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 본 연구는 상부 경추 신경절을 확실하게 식별하고 절제하여 교감신경계를 절제하는 수술 기법을 기술한다. 신경절의 성공적인 식별 및 제거는 형질전환 마우스를 사용하여 형광 교감신경절을 영상화하고, 절제 후 호너 증후군을 식별하고, 절제된 신경절에서 아드레날린 마커를 염색하고, 교감신경 절제술 후 표적 기관에서 감소된 아드레날린 면역형광을 관찰함으로써 검증됩니다. 이 모델은 암 진행뿐만 아니라 교감 신경계에 의해 조절되는 다른 생리적 과정에 대한 향후 연구를 가능하게 합니다.
서론
여러 연구에서 종양 미세 환경의 신경이 종양 진행을 지원하는 데 적극적인 역할을 한다고 보고했습니다. 아드레날린성 교감신경의 절제는 생체 내에서 전립선암과 위암의 종양 발달 및 파종을 저해하는 것으로 나타났으며1,2,3, 아드레날린성 수용체의 약리학적 차단은 두경부암의 종양 성장을 억제한다 4. 교감신경 침범은 또한 췌장암, 자궁경부암 및 기저 세포 암종 진행에서 설명되었습니다 5,6,7.
교감 신경계 내에서 상부 경추 신경절(SCG)은 머리를 자극하는 교감신경 줄기의 유일한 신경절입니다. SCG는 타액 분비 및 일주기 리듬과 같은 다양한 생리적 기능을 조절하고 자궁 경부 림프절을 직접 자극합니다 8,9,10. SCG는 또한 황반변성(macular degeneration)11 및 대동맥 박리(aortic dissection)12의 진행과 같은 병리학적 과정과 관련이 있다. 또한, SCG의 절제술은 허혈 재관류로 유발된 급성 신장 손상을 악화시키고13 또한 쥐14의 장내 미생물군을 변화시키는 것으로 보고되었다.
마우스 모델에서 SCG의 완전한 절제는 암 및 자율 신경계 연구를 가능하게 하는 귀중한 실험 기술을 나타냅니다. 많은 연구에서 약리학적 아드레날린 수용체 차단을 아드레날린 절제술로 활용했지만15,16,17,18,19,20, 외과적 절제술은 반복적인 약리학적 개입 및 관련 부작용의 필요성을 피하면서 완전하고 일방적인 아드레날린 절제를 가능하게 한다 21,22,23.
SCG의 외과적 절제술은 쥐24마리에서 설명되었으며, 우수한 경추 신경절 절제술(SCGx)의 효과를 연구하는 대부분의 보고서에서는 쥐 모델을 사용했습니다. 쥐 모델과 비교할 때 SCGx는 SCG의 크기가 작기 때문에 마우스에서 기술적으로 더 까다롭습니다. 그러나 마우스는 비교적 다루기 쉽고 비용 효율적이며 유전자 조작에 더 적합합니다. Garcia et al. 생쥐에서 SCGx를 보고한 최초의 사람 중 하나였으며 인슐린 방출에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다25. 보다 최근에, Ziegler et al. 쥐24,26에 대해 기술된 공개된 기술에 기초하여 마우스에서 SCGx를 기술하였다. 이 기사와 다른 기사에서는 총경동맥(CCA)을 먼저 식별하고 해부한 다음 CCA21,22,27,28의 분기점에서 SCG를 제거하는 방법을 설명합니다. 이 기사에서는 CCA의 해부를 피하는 덜 침습적이고 안전한 기술에 대해 설명하여 이 절차의 가장 심각한 합병증인 CCA 손상으로 인한 출혈을 최소화합니다.
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프로토콜
여기에 설명된 동물 절차는 메모리얼 슬론 케터링 암 센터(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 8주령의 수컷 및 암컷 NSG 마우스를 여기에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조). 기구는 멸균되고, 수술 작업 표면은 소독되고, 동물의 피부 표면은 소독되며, 외과 의사는 수술 내내 멸균 장갑을 착용합니다.
1. 마우스의 준비 및 수술 전 설정
- 수술 전날, 유도 챔버(폭 3.75 x 깊이 9 x 높이 3.75, 재료 표 참조)에서 2% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
참고: 마취 수술면은 일반적으로 개별 동물에 따라 3-5분 내에 이루어집니다. 발가락 꼬집음으로 마취의 적절성을 평가하고 이소플루란 비율을 적절하게 높입니다.- 목의 복부 측면을 면도하거나 제조업체의 지침에 따라 화학 제모제를 사용하십시오 ( 재료 표 참조).
- 수술 당일, 유도 챔버에서 2% 이소플루란으로 마우스를 마취한다. 발가락 꼬집음으로 마취의 적절성을 평가하고 이소플루란 비율을 적절하게 높입니다.
- 선제적 전신 진통을 위해 멜록시캄 2mg/kg을 피하 투여합니다. 국소 안과 연고( 재료 표 참조)를 바르면 안구 손상과 마취 시 건조를 예방할 수 있습니다.
- 마우스를 등쪽의 해부 현미경 아래에 놓고 열 지원을 제공합니다. 정밀 기화기와 노즈 콘을 사용하여 2%-2.5% 이소플루란으로 흡입 마취를 유지하십시오. 저자극성 테이프로 양쪽 앞다리를 부드럽게 고정합니다( 재료 표 참조).
- 면도한 목의 복부 부분을 포비돈 요오드로 닦은 다음 70% 알코올로 닦습니다. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. 수술 부위에 느슨한 머리카락이 없는지 확인하십시오.
알림: 한 쌍의 짧은 곡선 집게를 사용할 수도 있습니다. 이 제한된 공간에서 적절하게 작업하기 위해 한 쌍의 미세 또는 안과용 집게를 사용해야 합니다. 기관 지침에 따라 추가 수술 전 설정이 포함될 수 있습니다.
2. 해부
- 턱 아래 약 1.5mm에서 흉골 노치 위 2mm까지 작은 가위를 사용하여 목의 복부 부분에 2cm 정중선 피부 절개를 합니다.
- 집게로 피부 가장자리를 옆으로 수축시켜 밑에 있는 근막과 턱밑 침샘을 노출시킵니다. 양쪽 피부 아래에 뾰족한 가위를 삽입하고 펴서 밑에 있는 근막에서 피부를 분리합니다. 집게로 꼬리 아래로 턱밑 땀샘을 당겨 밑에 있는 근육을 드러냅니다.
- digastric muscle과 omohyoid muscle의 뒤쪽 배의 교차점을 찾습니다 (그림 1A, 검은 색 원). 전방 경정맥은 omohyoid 근육에 세로와 측면으로 달리는 것을 볼 수 있습니다.
참고: omohyoid 근육은 기관을 세로로 덮고 있는 반면, digastric 근육은 기관의 두개골 측면에 가로로 놓여 있습니다(그림 1C).- 전방 경정맥 측면의 이 접합부에 45° 각진 집게의 끝을 삽입하여 위에 있는 깊은 경추 근막에 구멍을 뚫고 퍼뜨립니다.
- 2.3.1단계에서 만든 이 창을 45° 각도의 집게로 열어 둡니다. 다른 손에 한 쌍의 구부러진 집게로 퍼짐 기동을 수행하여 이 개구부를 더 넓게 확장하십시오.
3. 신경절의 확인 및 절제술
- 공개된 공간의 측벽에서 상부 경추 신경절(SCG)을 찾습니다. 그것은 둥글고 진주 같은 조직으로 나타납니다.
참고: SCG가 식별되지 않으면 이 공간의 조직을 더 측면으로 그리고 상부하게 검사해야 합니다. SCG는 이 부위에 종종 존재하는 지방과 쉽게 혼동될 수 있습니다. 지방은 약간 노란색을 띠는 반면, SCG는 진주색으로 보입니다. - 다른 손으로 집게로 개구부를 유지하면서 집게로 SCG를 부드럽게 잡고 개구부에서 당겨 더 잘 볼 수 있도록 합니다.
- SCG가 시야에 들어오면 SCG가 여전히 주변 조직에 부착되어 있는 SCG의 측면 기저부를 잡습니다. 다른 손을 사용하여 SCG를 복부 및 꼬리 방향으로 천천히 부드럽게 집어넣습니다.
- SCG를 여러 번 수축시켜 신경절을 조금씩 점차적으로 찢습니다. 이 기동 중에 신경절을 온전하게 유지하여 잔여 신경절 잔해가 남지 않도록 합니다.
알림: 이 단계에서 출혈이 발생할 수 있으므로 신경절을 부드럽게 당깁니다. 경미한 출혈이 발생하면 산화된 재생 셀룰로오스 또는 작은 멸균 거즈 조각을 사용하여 30초에서 1분 동안 개구부에 압력을 유지합니다. 그런 다음 천천히 거즈를 들어 올려 재평가하십시오. 출혈이 멈출 때까지 필요에 따라 개구부에 압력을 가하는 과정을 반복하십시오.
- SCG를 여러 번 수축시켜 신경절을 조금씩 점차적으로 찢습니다. 이 기동 중에 신경절을 온전하게 유지하여 잔여 신경절 잔해가 남지 않도록 합니다.
- 신경절 기저부를 잡고 있는 다른 집게를 천천히 풉니다. 혈액 풀링을 찾아 출혈을 확인하십시오.
알림: 이때 약간의 진물이 나오는 것은 정상입니다. 시술을 종료하고 완료하기 전에 지속적이거나 심각한 출혈이 없는지 모니터링하고 확인하십시오. 이 경우 3.3.1 단계에 설명된 대로 개구부에 압력을 가하십시오. - 침샘을 정상적인 해부학적 위치로 되돌립니다. 간단한 중단 된 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 근사화하고 닫습니다 ( 재료 표 참조).
- 마우스를 깨끗한 케이지에 단독으로 넣어 마취에서 완전히 회복할 수 있도록 합니다.
알림: 마우스가 마취에서 완전히 깨어나는 데 5-15분이 소요될 수 있습니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 마우스를 다른 마우스와 함께 케이지에 넣지 마십시오. 72시간 동안 최소 24시간마다 한 번씩 수술 후 회복을 위해 마우스를 평가합니다.
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결과
이 프로토콜은 마우스 모델에서 SCG의 외과적 제거를 설명합니다. 그림 2 는 CCA, 전경정맥 및 SCG를 포함한 해부학적 랜드마크를 보여줍니다. 해부(그림 2A)를 통해 우측 전방 경정맥이 기관의 측면 경계를 따라 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 전경정맥보다 더 깊숙이 위치하기 때문에 왼쪽 CCA와 내경동맥(ICA)과 외경동맥(ECA)으로의 분기점은 정맥 측면에서만 희미하게 보입니다. NSG에서 이를 검사할 때. 형광 현미경 하에서 적색 형광 뉴런을 갖는 B6-P0TdTomato 형질전환 마우스(슈반 세포가 형광 적색, 미공개 연구인 P0-Cre TdTomato 마우스), 형광 미주 신경은 CCA에 측면으로 흐르는 것을 볼 수 있으며, 형광 SCG는 전방 경정맥 측면의 CCA의 분기점에서 볼 수 있습니다(그림 2B).
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토론
이 프로토콜은 SCG 입력의 외과적 편측 절제를 위한 마우스 모델을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 다양한 환경에서 아드레날린 성 신경 분포의 효과를 연구 할 수 있습니다. 또한, 절제된 교감신경 신경절은 시험관내 실험(in vitro experiments)을 위한 3D 매트리겔 배양(3D matrigel culture)에서도 성장할 수 있다 30.
SCGx와 관련된 연구는 해부학적 구조가 더 커서 해부학적 시각화 및 해부가 더 쉽기 때문에 대부분 쥐에서 수행되었습니다. 마우스의 SCGx는 이전에 Ziegler et al.26에 의해 기술되었고 다른 연구21,22,27,28에서 간략하게 보고되었지만, 이 기술은 SCG의 절제 전에 CCA가 노출되고 해부되는...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Q. W.는 NIH T32CA009685의 지원을 받았습니다. RJW는 NIH R01CA219534의 지원을 받았습니다. 메모리얼 슬론 케터링 암 센터 핵심 시설은 NIH P30CA008748의 지원을 받았습니다.
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