Kirurgisk teknik til overlegen cervikal ganglionektomi i en murinmodel
Summary
Denne protokol beskriver en musemodel af ablation af adrenerg innervering ved at identificere og resektere den overlegne cervikale ganglion.
Abstract
Voksende beviser tyder på, at det sympatiske nervesystem spiller en vigtig rolle i kræftprogression. Adrenerg innervering regulerer spytkirtelsekretion, døgnrytme, makuladegeneration, immunfunktion og hjertefysiologi. Murinkirurgisk sympathektomi er en metode til at studere virkningerne af adrenerg innervering ved at muliggøre fuldstændig, ensidig adrenerg ablation, samtidig med at behovet for gentagen farmakologisk intervention og de tilhørende bivirkninger undgås. Imidlertid er kirurgisk sympatektomi hos mus teknisk udfordrende på grund af den lille størrelse af den overlegne cervikale ganglion. Denne undersøgelse beskriver en kirurgisk teknik til pålideligt at identificere og resektere den overlegne cervikale ganglion for at ablate det sympatiske nervesystem. Den vellykkede identifikation og fjernelse af ganglion valideres ved at afbilde de fluorescerende sympatiske ganglier ved hjælp af en transgen mus, identificere Horners syndrom efter resektion, farvning for adrenerge markører i de resekterede ganglier og observere nedsat adrenerg immunfluorescens i målorganerne efter sympathektomi. Denne model muliggør fremtidige studier af kræftprogression såvel som andre fysiologiske processer reguleret af det sympatiske nervesystem.
Introduction
Flere undersøgelser har rapporteret, at nerverne i tumormikromiljøet spiller en aktiv rolle i at støtte tumorprogression. Ablation af adrenerge sympatiske nerver har vist sig at forringe tumorudvikling og formidling i prostata- og gastrisk cancer in vivo 1,2,3, mens den farmakologiske blokade af adrenerge receptorer hæmmer tumorvækst i hoved- og halskræft4. Sympatisk neural involvering er også blevet beskrevet i pancreas, cervikal og basalcellekarcinom progression 5,6,7.
Inden for det sympatiske nervesystem er den overlegne cervikale ganglion (SCG) den eneste ganglion i den sympatiske bagagerum, der inderverer hovedet. SCG regulerer forskellige fysiologiske funktioner, såsom spytsekretion og døgnrytme, og inderverer direkte de cervikale lymfeknuder 8,9,10. SCG har også været impliceret i patologiske processer såsom makuladegeneration11 og progression af aorta dissektion12. Derudover er resektion af SCG blevet rapporteret at forværre iskæmi reperfusionsinduceret akut nyreskade13 og også ændre tarmmikrobiota hos rotter14.
Den fuldstændige ablation af SCG i en musemodel ville repræsentere en værdifuld eksperimentel teknik til at muliggøre forskning i kræft og autonomt nervesystem. Mens mange undersøgelser har udnyttet farmakologisk adrenerg receptorblokade som en adrenerg ablation 15,16,17,18,19,20, tillader kirurgisk resektion fuldstændig ensidig adrenerg ablation, samtidig med at behovet for gentagen farmakologisk intervention og de tilhørende bivirkninger undgås 21,22,23.
Kirurgisk resektion af SCG er blevet beskrevet hos rotter24, og de fleste rapporter, der studerer effekten af overlegen cervikal ganglionektomi (SCGx), har anvendt rottemodellen. Sammenlignet med rottemodellen er SCGx teknisk mere udfordrende i mus på grund af SCG’ens lille størrelse. Imidlertid er mus forholdsvis lettere at håndtere, mere omkostningseffektive og mere modtagelige for genetisk manipulation. Garcia et al. var en af de første til at rapportere SCGx hos mus, og det viste sig at påvirke insulinfrigivelse25. For nylig beskrev Ziegler et al. SCGx i mus baseret på den offentliggjorte teknik beskrevet for rotter24,26. Denne og andre artikler beskriver en metode, hvor den fælles halspulsåre (CCA) først identificeres og dissekeres, og SCG efterfølgende fjernes fra bifurkationen af CCA21,22,27,28. I denne artikel beskrives en mindre invasiv og sikrere teknik hos mus, der undgår dissektion af CCA og derved minimerer den mest alvorlige komplikation ved denne procedure – blødning fra en skade på CCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en musemodel til kirurgisk ensidig ablation af SCG-input. Denne teknik giver mulighed for at studere virkningerne af adrenerg innervering i forskellige indstillinger. Derudover kan den resekterede sympatiske ganglion også dyrkes i 3D matrigel kultur til in vitro forsøg30.
Undersøgelser, der involverer SCGx, er for det meste blevet udført på rotter, da deres større anatomi giver mulighed for lettere anatomisk visualisering og disse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Q. W. blev støttet af NIH T32CA009685. R. J. W. blev støttet af NIH R01CA219534. Memorial Sloan Kettering Cancer Center Core Facilities blev støttet af NIH P30CA008748.
Materials
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
References
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
- Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115 (2014).
- Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
- Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
- Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
- Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
- Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
- Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
- Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
- Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
- Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
- Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
- Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
- Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
- Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
- Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
- Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
- Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
- Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
- Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
- Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
- Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
- Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. 신경과학. 120 (3), 827-836 (2003).
- Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
- Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
- Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
- Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
- Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
- Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
- Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
- Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).
