Collecte dynamique en temps réel de liquide extracellulaire hippocampique de rats conscients à l’aide d’un système de microdialyse
Summary
Le protocole fournit ici un échantillonnage dynamique détaillé en temps réel du liquide extracellulaire de l’hippocampe de rats éveillés à l’aide d’un système de microdialyse.
Abstract
Diverses maladies du système nerveux central (SNC) sont associées à des changements dans la composition du liquide extracellulaire hippocampique (HECF). Cependant, la difficulté d’obtenir des HECF en temps réel à partir de rats conscients a longtemps limité l’évaluation de la progression de la maladie du SNC et l’efficacité de la thérapie ethnomédicale. Il est encourageant de constater qu’une technique de microdialyse cérébrale peut être utilisée pour l’échantillonnage continu avec les avantages de l’observation dynamique, de l’analyse quantitative et d’une petite taille d’échantillonnage. Cela permet de surveiller les changements dans la teneur en liquide extracellulaire pour les composés des herbes traditionnelles et leurs métabolites dans le cerveau des animaux vivants. Le but de cette étude était donc d’implanter avec précision une sonde de microdialyse du liquide céphalorachidien dans la région hippocampique de rats Sprague Dawley (SD) avec un appareil stéréotaxique cérébral tridimensionnel, coupant des poids moléculaires supérieurs à 20 kDa. Le HECF de haute qualité a ensuite été obtenu à partir de rats conscients à l’aide d’un système de contrôle d’échantillonnage par microdialyse avec un taux d’échantillonnage réglable de 2,87 nL/min à 2,98 mL/min. En conclusion, notre protocole fournit une méthode efficace, rapide et dynamique pour obtenir HECF chez des rats éveillés à l’aide de la technologie de microdialyse, ce qui nous offre des possibilités illimitées d’explorer davantage la pathogenèse des maladies liées au SNC et d’évaluer l’efficacité des médicaments.
Introduction
Les maladies du système nerveux central (SNC) à forte morbidité, telles que les maladies neurodégénératives, les lésions cérébrales traumatiques, les lésions cérébrales induites par l’hypoxie à haute altitude et les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, sont des causes cruciales de la mortalité croissante dans le monde 1,2,3. La surveillance en temps réel des cytokines et des changements protéiques dans des régions spécifiques du cerveau contribue à la précision diagnostique des maladies du SNC et des études pharmacocinétiques du cerveau après la médication. La recherche scientifique traditionnelle utilise l’homogénat de tissu cérébral ou une collection manuelle de liquide cérébral interstitiel animal pour la détection de substances spécifiques et pour les études pharmacocinétiques. Toutefois, cela présente certaines lacunes, telles qu’une taille d’échantillon limitée, l’incapacité d’observer dynamiquement les changements d’indicateurs et une qualité d’échantillonnage inégale 4,5,6. Le liquide céphalorachidien, un liquide interstitiel, protège le cerveau et la moelle épinière contre les dommages mécaniques. Sa composition est différente de celle du sérum en raison de l’existence de la barrière hémato-encéphalique (BHE)7. L’analyse directe d’échantillons de liquide céphalorachidien est plus propice à la divulgation du mécanisme des lésions du SNC et à la découverte de médicaments. Inévitablement, les échantillons de liquide céphalorachidien, obtenus manuellement directement à partir de la citerne magna et des ventricules cérébraux à l’aide d’une seringue, présentent des inconvénients de contamination du sang, une chance aléatoire de prélèvement d’échantillons, une incertitude de quantité et presque aucune possibilité de prélèvement multiple 8,9. Plus particulièrement, les méthodes conventionnelles d’échantillonnage interstitiel des fluides cérébraux ne permettent pas d’obtenir des échantillons des régions cérébrales endommagées, ce qui entrave l’exploration de la pathogenèse des maladies du SNC dans des régions spécifiques du cerveau et l’évaluation de l’efficacité des thérapies ethnomédicales ciblées 9,10.
La microdialyse cérébrale est une technique d’échantillonnage du liquide cérébral interstitiel chez les animaux éveillés11. Le système de microdialyse imite la perméabilité vasculaire à l’aide d’une sonde implantée dans le cerveau. La sonde de microdialyse est armée d’une membrane semi-perméable et est implantée dans des régions spécifiques du cerveau. Après perfusion avec du liquide céphalorachidien artificiel isotonique (ACSF), le liquide cérébral interstitiel dialysé peut être recueilli favorablement avec les avantages de la petite taille des échantillons, de l’échantillonnage continu et de l’observation dynamique12,13. En termes d’emplacement, les sondes de microdialyse cérébrale peuvent être implantées sélectivement dans des structures cérébrales ou des citernes crâniennes d’intérêt14. L’observation de niveaux anormaux d’une substance endogène dans le liquide extracellulaire de l’hippocampe (HECF) suggère l’apparition de maladies du SNC ou la pathogenèse de la maladie. Plusieurs études ont montré que les biomarqueurs des maladies du SNC, tels que les acides aminés D dans la schizophrénie, les protéines β-amyloïdes et tau dans la maladie d’Alzheimer, les chaînes légères de neurofilaments dans les lésions cérébrales traumatiques et l’ubiquitine carboxy-terminale hydrolase L1s dans l’encéphalopathie hypoxique ischémique, peuvent être analysés dans le liquide céphalorachidien15,16,17 . Une méthode d’analyse chimique basée sur la technique d’échantillonnage par microdialyse cérébrale peut être utilisée pour surveiller les changements dynamiques de composés exogènes tels que les principes actifs de l’ethnomédecine, qui diffusent et distribuent dans des régions spécifiques du cerveau14.
Cet article présente le processus spécifique d’acquisition dynamique de HECF chez les rats éveillés et mesure sa pression osmotique pour assurer la qualité de l’échantillon.
Protocol
Representative Results
Discussion
La pathogenèse des maladies du SNC n’est pas encore entièrement comprise, ce qui entrave le développement de nouvelles thérapies et médicaments. Des études ont montré que la plupart des maladies du SNC sont étroitement liées aux lésions de l’hippocampe20,21,22. La technique de microdialyse cérébrale proposée peut cibler des régions spécifiques du cerveau, en particulier l’hippocampe, ce qui la distingue de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82104533), le Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (2021YJ0175) et la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2020M683273). Les auteurs tiennent à remercier M. Yuncheng Hong, ingénieur principal en équipement chez Tri-Angels D & H Trading Pte. Ltd. (Singapour) pour avoir fourni des services techniques pour la technique de microdialyse.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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