이 프로토콜은 형광Ca2+ 센서 GCaMP5G를 사용하여 천연 요로상피 세포에서 기계적으로 활성화된 이온 채널의 기능을 평가하는 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기계적으로 활성화된 이온 채널은 스트레치 또는 전단력과 같은 기계적 자극을 전기 및 생화학적 신호로 변환하는 생물학적 변환기입니다. 포유류에서 기계적으로 활성화된 채널은 촉각 감각, 청각, 적혈구 부피 조절, 기초 혈압 조절 및 방광 충만 감각과 같은 다양한 과정에서 외부 및 내부 자극을 감지하는 데 필수적입니다. 기계적으로 활성화된 이온 채널의 기능은 패치 클램프 기술을 사용하여 시험관 내 설정에서 광범위하게 연구되었지만, 이러한 채널의 발현 부위에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 기본 환경에서 그 기능을 평가하는 것은 여전히 어려운 작업입니다(예: 구심성 말단, 메르켈 세포, 압수용기 및 신장 세뇨관) 또는 패치 클램프 기술 적용의 어려움(예: 요로상피 우산 세포의 정점 표면). 이 프로토콜은 생체 외 요로상피 제제에서 형광 센서 GCaMP5G를 사용하여 기계적으로 유발된 Ca 2+ 과도 현상을 평가하는 절차를 설명하며, 이는 다른 천연 조직 제제에서 기계적으로 유발된 Ca2+ 사건의 연구에 쉽게 적용할 수 있는 기술입니다.
서론
요로의 상피 세포는 요로 여과액이 네프론을 통과할 때 기계적 힘을 받고 소변은 신장 골반에서 펌핑되어 요관을 통해 이동하여 방광에 저장됩니다. 요로를 둘러싸고 있는 상피 세포의 체액에 의해 가해지는 기계적 힘(예: 전단 응력 및 스트레치)이 근위 세뇨관의 단백질과 원위 네프론 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11의 용질의 재흡수를 조절한다는 것은 오랫동안 인식되어 왔습니다. 12,13, 방광 및 배뇨에 소변....
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프로토콜
동물의 관리 및 취급은 University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee에 따라 수행되었습니다. 암컷, 2-4개월 된 C57Bl/6J 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 상업적으로 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. 장비 조립 및 설정
- 고해상도 카메라와 안정적인 광원이 장착된 정립 현미경으로 Ca2+ 이미징을 수행합니다( 재료 표 참조).
- USB 디지털 I/O 디바이스를 통해 카메라, 광원 및 피에조 액추에이터를 직접 제어할 수 있는 현미경 호환 소프트웨어로 이미지를 수집합니다( 재료 표 참조).
알림: 그림 1 은 설정의 개략도를 나타냅니다. GCaMP5G는 470 nm의 피크 여기 파장 및 497 nm의 피크 방출 파장을 갖는다28. GCaMP5G 이미징에 적합한 필터 큐브를 사용하십시오.
- USB 디지털 I/O 디바이스를 통해 카메라, 광원 및 피에조 액추에이터를 직접 제어할 수 있는 현미경 호환 소프트웨어로 이미지를 수집합니다( 재료 표 참조).
- 방광 점막 준비에서 개별 요로상피 세포를 자극하....
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결과
본 프로토콜은 형광Ca2+ 센서 GCaMP5G를 사용하여 우산 세포에서 기계적으로 유발된Ca2+ 과도 현상을 평가하는 기술을 기술한다. 아데노바이러스 형질도입은 요로상피 세포에서 GCaMP5G를 발현하기 위해 사용되었는데, 그 이유는 GCaMP5G의 높은 효율과 높은 수준의 발현을 생성하기 때문입니다. 형질도입된 방광에서 염색된 극저온 절편의 형광 이미지는 그림 2D에 나와 있습니다. 이러한 실험에서 GCaMP5G 발현은 우산 세포층에서 가장 높습니다. 우산 셀을 찌르는 실험 중에 캡처된 일련의 대표 이미지가 그림 3A에 나와 있습니다. 그림 3A의 첫 번째 이미지는 GCaMP5G를 발현하는 방광 점막의 우산 세포 상단에 위치한 자극 피펫의 형광 보기를 보여줍니다. GCaMP5G를 발현하는 우산 세포의 기계적 자극은 변형을 일으키고.......
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토론
모든 유기체, 그리고 겉보기에 대부분의 세포 유형은 기계적 자극에 반응하는 이온 채널을 발현합니다 20,33,34,35,36,37. 이러한 기계적으로 활성화된 채널의 기능은 주로 패치 클램프 기술로 평가되었습니다. 그러나 접근성 문제로 인해 기계적으로 활성화된 이온 채널에 대한 패치 클램프 연구는 해리된 세포와 세포주로 제한되었습니다. 기계적으로 활성화된 많은 이온 채널이 Ca2+를 투과할 수 있기 때문에 현미경, 생체 감지 및 미세 조작의 최근 발전을 활용하여 생체 외 요로상피 제제에서 기계적으로 활성화된 채널의 기능을 평가하는 이미징 방법을.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에) 및 S10OD028596(GA에)과 Pittsburgh Center for Kidney Research(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20x 대물 | 렌즈 Olympus | UMPlanFL N | |
| 24G ¾ ” 카테터 | Medline | Suresite IV 슬라이드 | |
| 4x 객관적인 | Olympus | UPlanFL N | |
| 아날로그/디지털 변환기 | 분자 장치 | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP 항체 | Abcam | Ab6556 | |
| 빔 스플리터 | Chroma | T495lpxr | |
| 바이폴라 온도 컨트롤러 | 워너 인스트루먼트 | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M 솔루션 |
| cellSens 소프트웨어 | Olympus | 이미징 소프트웨어 | |
| CMOS 카메라 | 하마마츠 | ORCA 융합 | |
| 당나귀 안티-토끼 Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| 엑셀 | 마이크로소프트 코퍼레이션 | ||
| 필터 | 크로마 | ET470/40X | |
| 유리 모세관 Corning 8250 유리 | 워너 인스트루먼트 | G85150T-4 | |
| 글루코스 | 시그마 | G8270 | |
| HEPES | 시그마 | H4034 | |
| 인라인 히터 | 워너 인스트루먼트 | SH-27B | |
| KCl | 시그마 | 793590 | |
| 광원 | 셔터 인스트루먼트 | 람다 XL | |
| 매니폴드 펌프 튜빙 | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| 매니폴드 펌프 튜빙 | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| 마우스 | 잭슨 랩 | 664 | 2-4개월 된 암컷 C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| 마이크로매니퓰레이터 | 셔터 악기 | MP-285 | |
| 현미경 | 올림푸스 | BX51W | |
| Invitrogen | S36964 | 가 포함된 마운팅 미디어 | DAPI를 사용한 슬로우페이드 다이아몬드 안티페이 |
| 나클 | Sigma | S7653 | |
| pClamp 소프트웨어 | Molecular Devices | 버전 10.4 | 패치 클램프 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 |
| 연동 펌프 | Gilson | Minipuls 3 | |
| 압전 액추에이터 | Thorlabs | PAS005 | |
| 피펫 홀더 | World Precision Instruments | ||
| 피펫 풀러 | Narishige | PP-830 | |
| 퀵 익스체인지 히팅 베이스와 관류 및 어댑터 링 키트 | 워너 인스트루먼트 | QE-1 | 퀵 교환 플랫폼은 35mm 접시에 맞습니다 |
| 로다민-팔로이딘 | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | 버전 14.0 | 과학 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어 |
| 실리콘 엘라스토머 | Dow | Sylgard 184 | |
| 단일 채널 개방 루프 피에조 컨트롤러 | Thorlabs | MDT694B | |
| 스퀘어 그리드 홀더 패드 | Ted Pella | 10520 | |
| 봉합 | AD 외과 | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| 테프론 장착 막대 | 맞춤형 | 마이크로 매니퓰레이터에 압전 액추에이터를 장착하는 데 사용 | |
| 튜빙 | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB 디지털 I/O 장치 | 내쇼날인스트루먼트 | NI USB-6501 |
참고문헌
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C.
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재인쇄 및 허가
