Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali
Summary
Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l’attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.
Abstract
L’epitelio intestinale si rigenera ogni 5-7 giorni ed è controllato dalla popolazione di cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) situata nella parte inferiore della regione della cripta. Gli IESC includono cellule staminali attive, che si auto-rinnovano e si differenziano in vari tipi di cellule epiteliali, e cellule staminali quiescenti, che fungono da cellule staminali di riserva in caso di lesioni. La rigenerazione dell’epitelio intestinale è controllata dalle capacità auto-rinnovanti e differenzianti di questi IESC attivi. Inoltre, l’equilibrio della popolazione di cellule staminali della cripta e il mantenimento della nicchia delle cellule staminali sono essenziali per la rigenerazione intestinale. La coltura di organoidi è un approccio importante e attraente per studiare proteine, molecole di segnalazione e segnali ambientali che regolano la sopravvivenza e le funzioni delle cellule staminali. Questo modello è meno costoso, meno dispendioso in termini di tempo e più manipolabile rispetto ai modelli animali. Gli organoidi imitano anche il microambiente tissutale, fornendo rilevanza in vivo . Il presente protocollo descrive l’isolamento delle cripte del colon, incorporando queste cellule isolate in un sistema tridimensionale di matrice di gel e coltivando cellule criptate per formare organoidi del colon capaci di auto-organizzazione, proliferazione, auto-rinnovamento e differenziazione. Questo modello consente di manipolare l’ambiente – eliminando proteine specifiche come la claudina-7, attivando / disattivando le vie di segnalazione, ecc. – per studiare come questi effetti influenzano il funzionamento delle cellule staminali del colon. In particolare, è stato esaminato il ruolo della proteina a giunzione stretta claudina-7 nella funzione delle cellule staminali del colon. Claudin-7 è vitale per mantenere l’omeostasi intestinale e la funzione e l’integrità della barriera. Il knockout di claudina-7 nei topi induce un fenotipo infiammatorio simile alla malattia intestinale che mostra infiammazione intestinale, iperplasia epiteliale, perdita di peso, ulcerazioni della mucosa, desquamazione delle cellule epiteliali e adenomi. In precedenza, è stato riportato che la claudina-7 è necessaria per le funzioni delle cellule staminali epiteliali intestinali nell’intestino tenue. In questo protocollo, viene stabilito un sistema di coltura organoide del colon per studiare il ruolo della claudina-7 nell’intestino crasso.
Introduction
La coltura organoide intestinale è un sistema tridimensionale (3D) ex vivo in cui le cellule staminali sono isolate dalle cripte intestinali del tessuto primario e placcate in una matrice di gel 1,2. Queste cellule staminali sono capaci di auto-rinnovamento, auto-organizzazione e funzionalità degli organi2. Gli organoidi imitano il microambiente tissutale e sono più simili ai modelli in vivo rispetto ai modelli di coltura cellulare in vitro bidimensionale (2D), sebbene meno manipolabili delle cellule 3,4. Questo modello elimina gli ostacoli incontrati nei modelli 2D, come la mancanza di adeguate aderenze cellula-cellula, interazioni cellula-matrice e popolazioni omogenee, e riduce anche i limiti dei modelli animali, inclusi costi elevati e lunghi periodi di tempo5. Gli organoidi intestinali – noti anche come colonoidi per quelli cresciuti da cellule staminali derivate dalla cripta del colon – sono essenzialmente mini-organi che contengono un epitelio che include tutti i tipi di cellule che sarebbero presenti in vivo, così come un lume. Questo modello consente la manipolazione del sistema per studiare molti aspetti dell’intestino, come la nicchia delle cellule staminali, la fisiologia intestinale, la fisiopatologia e la morfogenesi intestinale 3,5,6. Fornisce anche un ottimo modello per la scoperta di farmaci, studiando i disturbi intestinali umani come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e il cancro del colon-retto, lo sviluppo di trattamenti personalizzati specifici per il paziente e lo studio della rigenerazione dei tessuti 4,7,8,9. Inoltre, il sistema organoide può anche essere utilizzato per studiare la comunicazione cellulare, il metabolismo dei farmaci, la vitalità, la proliferazione e la risposta agli stimoli 7,8. Mentre i modelli animali possono essere utilizzati per testare potenziali terapie per le condizioni patologiche intestinali, sono piuttosto limitati, poiché lo studio di più farmaci contemporaneamente rappresenta una sfida. Ci sono più variabili confondenti in vivo, e il costo e il tempo associati sono rispettivamente alti e lunghi. D’altra parte, il sistema di coltura organoide consente lo screening di molte terapie contemporaneamente in un periodo di tempo più breve e consente anche un trattamento personalizzato attraverso l’uso di colture organoidi derivate dal paziente 4,8. La capacità degli organoidi del colon di imitare l’organizzazione, il microambiente e la funzionalità dei tessuti li rende anche un modello eccellente per studiare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti9. Il nostro laboratorio ha stabilito un sistema di coltura di organoidi dell’intestino tenue per studiare l’effetto della claudina-7 sulle funzioni delle cellule staminali dell’intestino tenue10. In questo studio, viene stabilito un grande sistema di coltura organoide intestinale per studiare la capacità, o la mancanza di capacità, delle cellule staminali di auto-rinnovarsi, differenziarsi e proliferare in un modello condizionale di knockout di claudina-7 (cKO).
La claudina-7 è una proteina a giunzione stretta (TJ) molto importante che è altamente espressa nell’intestino ed è essenziale per mantenere la funzione e l’integrità di TJ11. I topi cKO soffrono di un fenotipo simile a IBD, che mostra grave infiammazione, ulcerazioni, desquamazione delle cellule epiteliali, adenomi e aumento dei livelli di citochine11,12. Mentre è ampiamente accettato che le claudine sono vitali per la funzione di barriera epiteliale, stanno emergendo nuovi ruoli per le claudine; Sono coinvolti nella proliferazione, migrazione, progressione del cancro e funzione delle cellule staminali 10,12,13,14,15,16,17. Attualmente non è noto come la claudina-7 influenzi la nicchia e la funzione delle cellule staminali del colon. Poiché l’intestino si auto-rinnova rapidamente circa ogni 5-7 giorni, il mantenimento della nicchia delle cellule staminali e il corretto funzionamento delle cellule staminali attive è vitale18. Qui viene istituito un sistema per esaminare i potenziali effetti regolatori della claudina-7 sulla nicchia delle cellule staminali del colon.
Protocol
Representative Results
Discussion
La coltura di organoidi è un modello eccellente per studiare la funzione delle cellule staminali, la fisiologia intestinale, la scoperta di farmaci, le malattie intestinali umane e la rigenerazione e riparazione dei tessuti 7,8,9,10,11,26. Sebbene abbia molti vantaggi, può essere difficile da stabilire. È necessario presta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato da NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
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