Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles
Summary
Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.
Abstract
Pulldown est un test d’interaction protéine-protéine facile et largement utilisé. Cependant, il a des limites dans l’étude des complexes protéiques qui ne s’assemblent pas efficacement in vitro. De tels complexes peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel et la présence de chaperons moléculaires; Soit ils forment des oligomères stables qui ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro , soit ils sont instables sans partenaire liant. Pour surmonter ces problèmes, il est possible d’utiliser une méthode basée sur la co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement en utilisant un ensemble de vecteurs compatibles suivi des techniques conventionnelles de pulldown. Le flux de travail est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée en raison d’un nombre significativement plus petit d’étapes et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines qui existent dans l’environnement in vitro sont exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier un certain nombre d’interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées. La méthode peut être utilisée pour tester par lots les interactions protéine-protéine. Des résultats représentatifs sont présentés pour les études des interactions entre le domaine BTB et les protéines intrinsèquement désordonnées, et des hétérodimères des domaines associés aux doigts de zinc.
Introduction
Le pulldown conventionnel est largement utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine1. Cependant, les protéines purifiées n’interagissent souvent pas efficacement in vitro2,3, et certaines d’entre elles sont insolubles sans leur partenaire de liaison 4,5. De telles protéines peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel ou la présence de chaperons moléculaires 5,6,7,8,9. Une autre limitation du pulldown conventionnel est le test d’une activité d’hétéromultimérisation possible entre des domaines qui peuvent exister sous forme d’homo-oligomères stables assemblés co-translationnellement 8,10, car beaucoup d’entre eux ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro pendant le temps d’incubation. La co-expression s’est avérée utile pour surmonter ces problèmes 3,11. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles chez les bactéries a été utilisée avec succès pour purifier de grands complexes macromoléculaires multi-sous-unités, y compris le complexe répressif polycomb PRC212, le module de tête de médiateur de l’ARN polymérase II13, la plaque de base du bactériophage T414, le module de déubiquitinylase du complexe SAGA 15,16 et la ferritine17. Les origines de réplication couramment utilisées pour la co-expression sont ColE1, p15A18, CloDF1319 et RSF20. Dans le système d’expression Duet disponible dans le commerce, ces origines sont combinées avec différents gènes de résistance aux antibiotiques et plusieurs sites de clonage pratiques pour produire des vecteurs polycistroniques, permettant l’expression de jusqu’à huit protéines. Ces origines ont des numéros de copie différents et peuvent être utilisées dans différentes combinaisons pour atteindre des niveaux d’expression équilibrés des protéines cibles21. Pour tester les interactions protéine-protéine, diverses étiquettes d’affinité sont utilisées; les plus courantes sont la 6xHistidine, la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine de liaison au maltose (MBP), chacune ayant une affinité spécifique avec la résine correspondante. La GST et le MBP améliorent également la solubilité et la stabilité des protéines marquées22.
Un certain nombre de méthodes impliquant la co-expression des protéines dans les cellules eucaryotes ont également été développées, dont la plus importante est le test à deux hybrides de levure (Y2H)23. Le test Y2H est bon marché, facile et permet de tester de multiples interactions; Cependant, son flux de travail prend plus de 1 semaine à compléter. Il existe également quelques essais à base de cellules de mammifères moins fréquemment utilisés, par exemple, le test fluorescent à deux hybrides (F2H)24 et le test d’interaction protéine-protéine (CAPPIA)25. Le test F2H est relativement rapide, permettant d’observer les interactions protéiques dans leur environnement cellulaire natif, mais implique l’utilisation d’équipements d’imagerie coûteux. Toutes ces méthodes ont un avantage sur l’expression procaryote fournissant la traduction eucaryote native et l’environnement de repliement; Cependant, ils détectent l’interaction indirectement, soit par activation transcriptionnelle, soit par transfert d’énergie fluorescente, ce qui produit souvent des artefacts. En outre, les cellules eucaryotes peuvent contenir d’autres partenaires d’interaction de protéines d’intérêt, ce qui peut interférer avec le test des interactions binaires entre les protéines des eucaryotes supérieurs.
La présente étude décrit une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement suivie de techniques conventionnelles de pulldown. La méthode permet d’étudier les interactions entre les protéines cibles qui nécessitent une co-expression. Il est plus rapide que le pulldown traditionnel, permettant de tester par lots plusieurs cibles, ce qui le rend avantageux dans la plupart des cas. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles est plus pratique que la co-expression polycistronique car elle ne nécessite pas d’étape de clonage laborieuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite permet de tester les interactions protéine-protéine qui ne peuvent pas être assemblées efficacement in vitro et nécessitent une co-expression. La méthode est l’une des rares approches appropriées pour étudier les protéines hétérodimérantes, qui sont également capables d’homodimérisation puisque, lorsqu’elles sont purifiées séparément, ces protéines forment des homodimères stables qui ne peuvent le plus souvent pas se dissocier et se réassocie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par les projets 19-74-30026 (développement et validation de méthodes) et 19-74-10099 (essais d’interaction protéine-protéine); et par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie-subvention 075-15-2019-1661 (analyse des interactions protéine-protéine représentatives).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
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