Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.
Abstract
Pulldown ist ein einfacher und weit verbreiteter Protein-Protein-Interaktions-Assay. Es hat jedoch Einschränkungen bei der Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht effektiv zusammensetzen. Solche Komplexe können eine kotranslationale Assemblierung und das Vorhandensein von molekularen Chaperonen erfordern; Entweder bilden sie stabile Oligomere, die in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können, oder sie sind ohne Bindungspartner instabil. Um diese Probleme zu überwinden, ist es möglich, eine Methode zu verwenden, die auf der bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren basiert, gefolgt von den herkömmlichen Pulldown-Techniken. Der Workflow ist im Vergleich zum herkömmlichen Pulldown zeiteffizienter, da ihm die zeitaufwändigen Schritte der getrennten Aufreinigung interagierender Proteine und ihrer anschließenden Inkubation fehlen. Ein weiterer Vorteil ist eine höhere Reproduzierbarkeit aufgrund einer deutlich geringeren Anzahl von Schritten und einer kürzeren Zeitspanne, in der Proteine, die in der In-vitro-Umgebung existieren, einer Proteolyse und Oxidation ausgesetzt sind. Die Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung einer Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet, wenn sich andere In-vitro-Techniken als ungeeignet erwiesen haben. Die Methode kann für die Chargenprüfung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Repräsentative Ergebnisse werden für Studien zu Wechselwirkungen zwischen BTB-Domäne und intrinsisch ungeordneten Proteinen sowie zu Heterodimeren von Zinkfinger-assoziierten Domänen gezeigt.
Introduction
Konventioneller Pulldown wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen1. Gereinigte Proteine interagieren jedoch oft nicht effektiv in vitro2,3, und einige von ihnen sind ohne ihren Bindungspartner 4,5 unlöslich. Solche Proteine könnten eine co-translationale Assemblierung oder das Vorhandensein von molekularen Chaperonen 5,6,7,8,9 erfordern. Eine weitere Einschränkung des konventionellen Pulldowns ist die Prüfung möglicher Heteromultimerisierungsaktivität zwischen Domänen, die als stabile Homo-Oligomere existieren können, die kotranslational zusammengesetzt sind 8,10, da viele von ihnen während der Inkubationszeit in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können. Die Koexpression erwies sich als nützlich bei der Überwindung solcher Probleme 3,11. Die Koexpression unter Verwendung kompatibler Vektoren in Bakterien wurde erfolgreich zur Aufreinigung großer makromolekularer Komplexe mit mehreren Untereinheiten eingesetzt, einschließlich des Polycomb-Repressionskomplexes PRC2 12, des RNA-Polymerase-II-Mediatorkopfmoduls13, der Bakteriophagen-T4-Grundplatte14, des SAGA-Komplex-Deubiquitinylase-Moduls 15,16 und des Ferritins 17. Replikationsursprünge, die üblicherweise für die Koexpression verwendet werden, sind ColE1, p15A18, CloDF1319 und RSF20. Im kommerziell erhältlichen Duet-Expressionssystem werden diese Ursprünge mit verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen und geeigneten multiplen Klonierungsstellen kombiniert, um polycistronische Vektoren zu erzeugen, die die Expression von bis zu acht Proteinen ermöglichen. Diese Ursprünge haben unterschiedliche Kopienzahlen und können in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden, um ausgewogene Expressionsniveaus von Zielproteinenzu erreichen 21. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu testen, werden verschiedene Affinitäts-Tags verwendet; die gebräuchlichsten sind 6xHistidin, Glutathion-S-Transferase (GST) und Maltose-bindendes Protein (MBP), von denen jedes eine spezifische Affinität zum entsprechenden Harz aufweist. GST und MBP verbessern auch die Löslichkeit und Stabilität von markierten Proteinen22.
Es wurde auch eine Reihe von Methoden entwickelt, die die Koexpression von Proteinen in eukaryotischen Zellen beinhalten, von denen die bekannteste der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) ist23. Der Y2H-Assay ist kostengünstig, einfach und ermöglicht das Testen mehrerer Interaktionen. Der Workflow dauert jedoch mehr als 1 Woche. Es gibt auch einige weniger häufig verwendete Säugetierzell-basierte Assays, z. B. den Fluoreszenz-Zwei-Hybrid-Assay (F2H)24 und den Zellarray-Protein-Protein-Interaktions-Assay (CAPPIA)25. Der F2H-Assay ist relativ schnell und ermöglicht die Beobachtung von Proteininteraktionen in ihrer nativen zellulären Umgebung, erfordert jedoch die Verwendung teurer Bildgebungsgeräte. Alle diese Methoden haben einen Vorteil gegenüber der prokaryotischen Expression, die die native eukaryotische Translations- und Faltungsumgebung bereitstellt. Sie erkennen jedoch indirekt eine Interaktion, entweder durch transkriptionelle Aktivierung oder durch Fluoreszenzenergietransfer, wodurch häufig Artefakte entstehen. Eukaryotische Zellen können auch andere Interaktionspartner von Proteinen von Interesse enthalten, die das Testen binärer Wechselwirkungen zwischen Proteinen höherer Eukaryoten stören können.
Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen, gefolgt von konventionellen Pulldown-Techniken. Die Methode ermöglicht es, Wechselwirkungen zwischen Zielproteinen zu untersuchen, die eine Koexpression erfordern. Es ist im Vergleich zu herkömmlichem Pulldown zeiteffizienter und ermöglicht das Testen mehrerer Ziele, was es in den meisten Fällen vorteilhaft macht. Die Koexpression mit kompatiblen Vektoren ist bequemer als die polycistronische Co-Expression, da sie keinen mühsamen Klonschritt erfordert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in vitro nicht effizient zusammengesetzt werden können und eine Koexpression erfordern. Die Methode ist einer der wenigen geeigneten Ansätze zur Untersuchung heterodimerisierender Proteine, die ebenfalls zur Homodimerisierung fähig sind, da solche Proteine, wenn sie getrennt gereinigt werden, stabile Homodimere bilden, die während des Experiments meistens nicht dissoziieren und reassoziierenkönn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Projekte 19-74-30026 (Methodenentwicklung und -validierung) und 19-74-10099 (Protein-Protein-Interaktionsassays) der Russischen Wissenschaftsstiftung unterstützt. und vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation-Zuschuss 075-15-2019-1661 (Analyse repräsentativer Protein-Protein-Wechselwirkungen).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
