चुनौतीपूर्ण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए एक समय-कुशल उपकरण के रूप में बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन परख
Summary
यहां, हम संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, इसके बाद प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन तकनीकें हैं जो विट्रो में इकट्ठा नहीं हो सकती हैं।
Abstract
पुलडाउन एक आसान और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख है। हालांकि, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने में इसकी सीमाएं हैं जो विट्रो में प्रभावी ढंग से इकट्ठा नहीं होती हैं। ऐसे परिसरों को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली और आणविक चैपरोन की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है; या तो वे स्थिर ऑलिगोमर्स बनाते हैं जो विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं या बाध्यकारी साथी के बिना अस्थिर हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के आधार पर एक विधि का उपयोग करना संभव है। वर्कफ़्लो पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है क्योंकि इसमें बातचीत करने वाले प्रोटीन और उनके निम्नलिखित इनक्यूबेशन के अलग-अलग शुद्धिकरण के समय लेने वाले चरणों का अभाव है। एक और लाभ यह है कि चरणों की काफी कम संख्या और कम समय के कारण उच्च प्रजनन क्षमता है जिसमें इन विट्रो वातावरण के भीतर मौजूद प्रोटीन प्रोटियोलिसिस और ऑक्सीकरण के संपर्क में आते हैं। इस विधि को कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था जब अन्य इन विट्रो तकनीकों को अनुपयुक्त पाया गया था। विधि का उपयोग बैच परीक्षण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम बीटीबी डोमेन और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और जिंक-फिंगर से जुड़े डोमेन के हेटेरोडिमर्स के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए दिखाए गए हैं।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीनइंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, शुद्ध प्रोटीन अक्सर विट्रो 2,3 में प्रभावी ढंग से बातचीत नहीं करते हैं, और उनमें से कुछ अपने बाध्यकारी साथी 4,5 के बिना अघुलनशील होते हैं। ऐसे प्रोटीन को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली या आणविक चैपरोन 5,6,7,8,9 की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है। पारंपरिक पुलडाउन की एक और सीमा उन डोमेन के बीच संभावित हेटरोमल्टीमराइजेशन गतिविधि का परीक्षण है जो स्थिर होमो-ओलिगोमर्स के रूप में 8,10 को सह-अनुवाद के रूप में मौजूद हो सकते हैं, क्योंकि उनमें से कई इनक्यूबेशन समय के दौरान विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं। सह-अभिव्यक्ति को ऐसी समस्याओं पर काबू पाने में उपयोगी पाया गया 3,11. बैक्टीरिया में संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति का उपयोग बड़े मल्टी-सबयूनिट मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, जिसमें पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स पीआरसी 212, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय मध्यस्थ हेड मॉड्यूल13, बैक्टीरियोफेज टी 4 बेसप्लेट14, एसएजीए कॉम्प्लेक्स डियूबिकिटिनाइलेज मॉड्यूल15,16 और फेरिटिन17 शामिल थे। आमतौर पर सह-अभिव्यक्ति के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिकृति उत्पत्ति कोलई 1, पी15 ए 18, क्लोडीएफ13 19 और आरएसएफ20 हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डुएट अभिव्यक्ति प्रणाली में, इन उत्पत्ति को विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और पॉलीसिस्ट्रोनिक वैक्टर का उत्पादन करने के लिए सुविधाजनक कई क्लोनिंग साइटों के साथ जोड़ा जाता है, जिससे आठ प्रोटीन तक की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। इन उत्पत्ति में अलग-अलग प्रतिलिपि संख्याएं हैं और लक्ष्य प्रोटीन21 के संतुलित अभिव्यक्ति स्तरों को प्राप्त करने के लिए अलग-अलग संयोजनों में उपयोग किया जा सकता है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न आत्मीयता टैग का उपयोग किया जाता है; सबसे आम 6xHistidine, ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफेरेज़ (GST), और माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) हैं, जिनमें से प्रत्येक का संबंधित राल के लिए एक विशिष्ट संबंध है। जीएसटी और एमबीपी टैग किए गए प्रोटीन की घुलनशीलता और स्थिरता को भीबढ़ाते हैं।
यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति से जुड़े कई तरीके भी विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे प्रमुख खमीर दो-संकर परख (वाई 2 एच) 23 है। वाई 2 एच परख सस्ता, आसान है, और कई इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देता है; हालाँकि, इसका वर्कफ़्लो पूरा होने में 1 सप्ताह से अधिक समय लगता है। कुछ कम बार उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी सेल-आधारित परख भी हैं, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट टू-हाइब्रिड परख (एफ 2 एच) 24 और सेल सरणी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख (सीएपीपीआईए)25। एफ 2 एच परख अपेक्षाकृत तेज है, जिससे उनके मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का निरीक्षण करने की अनुमति मिलती है, लेकिन इसमें महंगे इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करना शामिल है। इन सभी विधियों में प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति पर एक लाभ है जो देशी यूकेरियोटिक अनुवाद और तह वातावरण प्रदान करता है; हालांकि, वे अप्रत्यक्ष रूप से बातचीत का पता लगाते हैं, या तो ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या फ्लोरोसेंट ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा, जो अक्सर कलाकृतियों का उत्पादन करता है। इसके अलावा, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में रुचि के प्रोटीन के अन्य इंटरैक्शन पार्टनर हो सकते हैं, जो उच्च यूकेरियोट्स के प्रोटीन के बीच बाइनरी इंटरैक्शन के परीक्षण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
वर्तमान अध्ययन में पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। विधि लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देती है जिसके लिए सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है, जिससे कई लक्ष्यों के बैच परीक्षण की अनुमति मिलती है, जो इसे ज्यादातर मामलों में फायदेमंद बनाती है। संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति पॉलीसिस्ट्रोनिक सह-अभिव्यक्ति की तुलना में अधिक सुविधाजनक है क्योंकि इसके लिए श्रमसाध्य क्लोनिंग चरण की आवश्यकता नहीं होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित विधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देती है जिसे विट्रो में कुशलतापूर्वक इकट्ठा नहीं किया जा सकता है और सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह विधि हेटेरोडिमराइजिंग प्रोटी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रूसी साइंस फाउंडेशन परियोजनाओं 19-74-30026 (विधि विकास और सत्यापन) और 19-74-10099 (प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख) द्वारा समर्थित किया गया था; और रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा अनुदान 075-15-2019-1661 (प्रतिनिधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण)।
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
