細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして
Summary
ここでは、適合ベクターのセットを使用して、タグ差のあるタンパク質を細菌で共発現させる方法について説明し、その後、 in vitroで組み立てられないタンパク質複合体を研究するための従来のプルダウン技術について説明します。
Abstract
プルダウンは、簡単で広く使用されているタンパク質間相互作用アッセイです。しかし、 in vitroで効果的に集合しないタンパク質複合体の研究には限界があります。そのような複合体は、共翻訳アセンブリおよび分子シャペロンの存在を必要とし得る。それらは、 in vitro で解離および再会合することができない安定なオリゴマーを形成するか、結合パートナーなしでは不安定である。これらの問題を克服するために、従来のプルダウン技術に続く一連の適合ベクターを用いた差次的タグタンパク質の細菌共発現に基づく方法を用いることができる。このワークフローは、相互作用するタンパク質の個別の精製とその後のインキュベーションという時間のかかるステップがないため、従来のプルダウンと比較して時間効率が高くなります。別の利点は、ステップ数が大幅に少なく、 in vitro 環境内に存在するタンパク質がタンパク質分解および酸化にさらされる期間が短いため、再現性が高いことです。この方法は、他の in vitro 技術が不適切であることが判明した場合に、多くのタンパク質間相互作用を研究するために首尾よく適用されました。この方法は、タンパク質間相互作用のバッチ試験に使用できます。BTBドメインと天然変性タンパク質との相互作用、および亜鉛フィンガー関連ドメインのヘテロ二量体の研究について、代表的な結果が示されています。
Introduction
従来のプルダウンは、タンパク質間相互作用の研究に広く使用されています1。しかしながら、精製されたタンパク質は、インビトロで効果的に相互作用しないことが多く2,3、それらのいくつかは、それらの結合パートナーなしでは不溶性である4,5。そのようなタンパク質は、共翻訳アセンブリまたは分子シャペロンの存在を必要とするかもしれない5,6,7,8,9。従来のプルダウンの別の制限は、共翻訳的に組み立てられた安定なホモオリゴマーとして存在し得るドメイン間のヘテロ多量体化活性の試験です8,10、それらの多くはインビトロで解離および再会合することができないため、インキュベーション時間中に。共発現は、このような問題を克服するのに有用であることがわかった3、11。細菌における適合ベクターを用いた共発現は、ポリコーム抑制複合体PRC2 12、RNAポリメラーゼIIメディエーターヘッドモジュール13、バクテリオファージT4ベースプレート14、SAGA複合体デユビキチニラーゼモジュール15、16、およびフェリチン17を含む大きなマルチサブユニット高分子複合体の精製に成功しました。共発現に一般的に使用される複製起点は、ColE1、p15A18、CloDF1319、およびRSF20です。市販のDuet発現システムでは、これらの起源を異なる抗生物質耐性遺伝子および便利な複数のクローニング部位と組み合わせてポリシストロニックベクターを作製し、最大8つのタンパク質の発現を可能にします。これらの起源は異なるコピー数を有し、標的タンパク質のバランスの取れた発現レベルを達成するために様々な組み合わせで使用することができる21。タンパク質間相互作用をテストするために、さまざまな親和性タグが使用されます。最も一般的なのは、6xヒスチジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、およびマルトース結合タンパク質(MBP)であり、それぞれが対応する樹脂に特異的な親和性を持っています。GSTおよびMBPはまた、タグ付きタンパク質の溶解性および安定性を高める22。
真核細胞におけるタンパク質共発現を含む多くの方法も開発されており、その中で最も顕著なのは酵母ツーハイブリッドアッセイ(Y2H)23です。Y2Hアッセイは安価で簡単で、複数の相互作用のテストが可能です。ただし、ワークフローが完了するまでに1週間以上かかります。また、蛍光ツーハイブリッドアッセイ(F2H)24 や細胞アレイタンパク質間相互作用アッセイ(CAPPIA)25など、あまり使用頻度の低い哺乳類細胞ベースのアッセイもいくつかあります。F2Hアッセイは比較的高速であり、天然の細胞環境でタンパク質相互作用を観察することができますが、高価なイメージング機器を使用する必要があります。これらの方法はすべて、ネイティブの真核生物の翻訳および折り畳み環境を提供する原核生物発現よりも優れています。しかし、それらは、転写活性化または蛍光エネルギー伝達のいずれかによって間接的に相互作用を検出し、しばしばアーティファクトを生成します。また、真核細胞は、目的のタンパク質の他の相互作用パートナーを含む可能性があり、これは、高等真核生物のタンパク質間の二元相互作用の試験を妨げる可能性がある。
本研究では、従来のプルダウン技術に従った、差次的にタグ付けされたタンパク質の細菌共発現の方法について説明しています。この方法では、共発現を必要とする標的タンパク質間の相互作用を研究することができます。従来のプルダウンに比べて時間効率が高く、複数のターゲットのバッチテストが可能で、ほとんどの場合に有利です。適合ベクターを用いた共発現は、面倒なクローニング工程を必要としないため、ポリシストロニック共発現よりも簡便である。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された方法は、インビトロで効率的に組み立てることができず、共発現を必要とするタンパク質間相互作用の試験を可能にする。この方法は、ヘテロ二量体化タンパク質を研究するための数少ない適切なアプローチの1つであり、別々に精製すると、そのようなタンパク質は、実験中に解離および再会合することが最も多い安定したホモ二量体を形成するため、ホモ二量体化も可能…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ロシア科学財団のプロジェクト19-74-30026(メソッド開発と検証)および19-74-10099(タンパク質間相互作用アッセイ)によってサポートされました。ロシア連邦科学高等教育省による助成金075-15-2019-1661(代表的なタンパク質間相互作用の分析)。
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
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