Pulldown-analys i kombination med samuttryck i bakterieceller som ett tidseffektivt verktyg för att testa utmanande protein-proteininteraktioner
Summary
Här beskriver vi en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer, följt av konventionella pulldown-tekniker för att studera proteinkomplex som inte kan monteras in vitro.
Abstract
Pulldown är en enkel och allmänt använd protein-proteininteraktionsanalys. Det har dock begränsningar när det gäller att studera proteinkomplex som inte monteras effektivt in vitro. Sådana komplex kan kräva samtranslationell montering och närvaron av molekylära chaperoner; Antingen bildar de stabila oligomerer som inte kan dissociera och återassociera in vitro eller är instabila utan en bindande partner. För att övervinna dessa problem är det möjligt att använda en metod baserad på bakteriellt samuttryck av differentiellt märkta proteiner med hjälp av en uppsättning kompatibla vektorer följt av de konventionella pulldown-teknikerna. Arbetsflödet är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown eftersom det saknar de tidskrävande stegen för separat rening av interagerande proteiner och deras efterföljande inkubation. En annan fördel är en högre reproducerbarhet på grund av ett betydligt mindre antal steg och en kortare tidsperiod där proteiner som finns i in vitro-miljön utsätts för proteolys och oxidation. Metoden användes framgångsrikt för att studera ett antal protein-proteininteraktioner när andra in vitro-tekniker visade sig vara olämpliga. Metoden kan användas för batchtestning av protein-proteininteraktioner. Representativa resultat visas för studier av interaktioner mellan BTB-domän och inneboende oordnade proteiner, och av heterodimerer av zinkfingerassocierade domäner.
Introduction
Konventionell neddragning används ofta för att studera protein-proteininteraktioner1. Renade proteiner interagerar emellertid ofta inte effektivt in vitro2,3, och vissa av dem är olösliga utan sin bindningspartner 4,5. Sådana proteiner kan kräva samtranslationell sammansättning eller närvaron av molekylära chaperoner 5,6,7,8,9. En annan begränsning av konventionell pulldown är testningen av möjlig heteromultimeriseringsaktivitet mellan domäner som kan existera som stabila homooligomerer monterade tillsammans 8,10, eftersom många av dem inte kan dissociera och återassociera in vitro under inkubationstiden. Samuttryck visade sig vara användbart för att övervinna sådana problem 3,11. Samuttryck med kompatibla vektorer i bakterier användes framgångsrikt för att rena stora makromolekylära komplex med flera subenheter, inklusive polykamrepressivt komplex PRC212, RNA-polymeras II mediatorhuvudmodul 13, bakteriofag T4-basplatta14, SAGA-komplex deubiquitinylasmodul 15,16 och ferritin 17. Replikeringsursprung som vanligtvis används för samuttryck är ColE1, p15A18, CloDF1319 och RSF20. I det kommersiellt tillgängliga Duet-uttryckssystemet kombineras dessa ursprung med olika antibiotikaresistensgener och lämpliga multipla kloningsställen för att producera polycistroniska vektorer, vilket möjliggör uttryck av upp till åtta proteiner. Dessa ursprung har olika kopienummer och kan användas i olika kombinationer för att uppnå balanserade uttrycksnivåer av målproteiner21. För att testa protein-proteininteraktioner används olika affinitetstaggar; de vanligaste är 6xHistidin, glutation-S-transferas (GST) och maltosbindande protein (MBP), som var och en har en specifik affinitet till motsvarande harts. GST och MBP förbättrar också lösligheten och stabiliteten hos märkta proteiner22.
Ett antal metoder som involverar proteinuttryck i eukaryota celler har också utvecklats, varav den mest framträdande är jäst tvåhybridanalys (Y2H)23. Y2H-analys är billig, enkel och möjliggör testning av flera interaktioner; Arbetsflödet tar dock mer än 1 vecka att slutföra. Det finns också några mindre frekventa däggdjurscellbaserade analyser, till exempel fluorescerande tvåhybridanalys (F2H)24 och cellmatrisprotein-proteininteraktionsanalys (CAPPIA)25. F2H-analys är relativt snabb, vilket gör det möjligt att observera proteininteraktioner i sin ursprungliga cellulära miljö, men innebär att man använder dyr bildutrustning. Alla dessa metoder har en fördel jämfört med prokaryot uttryck som ger den ursprungliga eukaryota översättnings- och vikningsmiljön; De detekterar emellertid interaktion indirekt, antingen genom transkriptionell aktivering eller genom fluorescerande energiöverföring, som ofta producerar artefakter. Eukaryota celler kan också innehålla andra interaktionspartners av proteiner av intresse, vilket kan störa testningen av binära interaktioner mellan proteiner av högre eukaryoter.
Den aktuella studien beskriver en metod för bakteriellt samuttryck av differentiellt taggade proteiner följt av konventionella pulldown-tekniker. Metoden gör det möjligt att studera interaktioner mellan målproteiner som kräver samuttryck. Det är mer tidseffektivt jämfört med traditionell pulldown, vilket möjliggör batchtestning av flera mål, vilket gör det fördelaktigt i de flesta fall. Samuttryck med kompatibla vektorer är bekvämare än polycistroniskt samuttryck eftersom det inte kräver ett mödosamt kloningssteg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna metoden möjliggör testning av protein-proteininteraktioner som inte kan monteras effektivt in vitro och kräver samuttryck. Metoden är en av de få lämpliga metoderna för att studera heterodimeriserande proteiner, som också kan homodimeriseras eftersom sådana proteiner, när de renas separat, bildar stabila homodimerer som oftast inte kan dissociera och återassociera under experimentet 3,11.
Arbetsflödet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Russian Science Foundation-projekten 19-74-30026 (metodutveckling och validering) och 19-74-10099 (protein-proteininteraktionsanalyser); och av Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning-bidrag 075-15-2019-1661 (analys av representativa protein-proteininteraktioner).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
