Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Summary

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kontrollierte Hyperthermie, die durch magnetresonanzgesteuerten, hochintensiven fokussierten Ultraschall erzeugt wird, zu verwenden, um die Wirkstofffreisetzung von temperaturempfindlichen Liposomen in einem Rhabdomyosarkom-Mausmodell auszulösen.

Abstract

Der magnetresonanzgesteuerte hochintensive fokussierte Ultraschall (MRgHIFU) ist eine etablierte Methode zur Erzeugung einer lokalisierten Hyperthermie. Aufgrund der Echtzeit-Bildgebung und der akustischen Energiemodulation ermöglicht diese Modalität eine präzise Temperaturregelung innerhalb eines definierten Bereichs. Mit dieser nicht-invasiven, nichtionisierenden Technologie werden viele thermische Anwendungen erforscht, wie z. B. die Erzeugung von Hyperthermie, um Medikamente aus thermosensitiven liposomalen Trägern freizusetzen. Zu diesen Medikamenten können Chemotherapien wie Doxorubicin gehören, bei denen aufgrund der dosisbegrenzenden systemischen Nebenwirkungen, nämlich der Kardiotoxizität, eine gezielte Freisetzung erwünscht ist. Doxorubicin ist eine tragende Säule für die Behandlung einer Vielzahl von bösartigen Tumoren und wird häufig bei rezidivierendem oder rezidivierendem Rhabdomyosarkom (RMS) eingesetzt. RMS ist der häufigste extrakranielle Tumor des soliden Weichgewebes bei Kindern und jungen Erwachsenen. Trotz aggressiver, multimodaler Therapie sind die Überlebensraten des RMS in den letzten 30 Jahren gleich geblieben. Um eine Lösung für diesen ungedeckten Bedarf zu finden, wurde ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Freisetzung von thermosensitivem liposomalem Doxorubicin (TLD) in einem immunkompetenten, syngenen RMS-Mausmodell zu untersuchen, das MRgHIFU als Quelle der Hyperthermie für die Wirkstofffreisetzung verwendet.

Introduction

Das Rhabdomyosarkom (RMS) ist ein Skelettmuskeltumor, der am häufigsten bei Kindern und jungen Erwachsenen auftritt¹. Lokalisierte Erkrankungen werden oft mit einer multimodalen Behandlung behandelt, einschließlich Chemotherapie, ionisierender Strahlung und Operation. Der Einsatz von Multi-Medikamenten-Chemotherapien ist bei pädiatrischen Patienten häufiger anzutreffen und hat im Vergleich zu ihren erwachsenen Kollegen bessere Ergebnisse^{erzielt 2}; Trotz laufender Forschungsbemühungen liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei der aggressivsten Form der Krankheit jedoch nach wie vor bei etwa 30 % ^3,4. Die Standardtherapie der Chemotherapie ist ein Multidrug-Schema, das Vincristin, Cyclophosphamid und Actinomycin D umfasst. Bei rezidivierender oder rezidivierender Erkrankung werden alternative Chemotherapien eingesetzt, darunter Standard-Doxorubicin (FD) und Ifosfamid¹. Während alle diese Chemotherapien systemische Toxizitäten aufweisen, erzwingt die Kardiotoxizität von Doxorubicin eine lebenslange Dosisbegrenzung^{von 5-7}. Um die Menge des an den Tumor abgegebenen Arzneimittels zu erhöhen und die systemische Toxizität zu minimieren, wurden alternative Formulierungen entwickelt, einschließlich liposomaler Verkapselung. Dabei kann es sich um nicht-thermosensitives Doxorubicin handeln, das für die Behandlung von Brustkrebs und hepatozellulärem Karzinom zugelassen ist, oder um thermosensitives Doxorubicin, für das klinische Studien laufen 8,9,10,11,12,13. Alternative Methoden zur Verabreichung liposomal verkapselter Arzneimittel wie multivesikuläre Liposomen und Liganden-gerichtete Liposomen wurden evaluiert und sind vielversprechend für die Behandlung von Tumoren⁹. In dieser Studie hat die Zugabe von Wärme multifaktorielle Auswirkungen, einschließlich der Wirkstofffreisetzung¹⁴. Die Kombination von Hyperthermie (HT), die mit magnetresonanzgesteuertem hochintensivem fokussiertem Ultraschall (MRgHIFU) und thermosensitivem liposomalem Doxorubicin (TLD) erzeugt wird, ist ein neuartiger multimodaler therapeutischer Ansatz für den Einsatz dieses toxischen, aber wirksamen Medikaments zur Behandlung von RMS, während gleichzeitig die dosislimitierende Toxizität minimiert und möglicherweise die Immunantwort auf den Tumor erhöht wird.

Doxorubicin wird bei Temperaturen von >39 °C schnell aus TLD freigesetzt, was weit über der durchschnittlichen menschlichen Körpertemperatur von 37 °C liegt, aber nicht hoch genug ist, um Gewebeschäden oder Ablation zu verursachen. Dies beginnt bei 43 °C, tritt aber schneller auf, wenn sich die Temperaturen 60 °C nähern¹⁵. Zur Erzeugung von HT in vivo wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter Laser, Mikrowellen, Radiofrequenzablation und fokussierter Ultraschall, von denen viele invasive Erhitzungsmethoden sind¹⁶. MRgHIFU ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Heizmethode, die eine präzise Temperatureinstellung innerhalb des Zielgewebes in situ ermöglicht. Die Magnetresonanztomographie (MR) bietet eine Echtzeit-Bildgebung, bei der Computersoftware verwendet werden kann, um eine thermometrische Messung des Gewebes während der gesamten Behandlung zu berechnen. Anschließend können diese Daten verwendet werden, um die Ultraschalltherapie in Echtzeit zu steuern, um einen gewünschten Temperatursollwert¹⁷ zu erreichen und zu halten. MRgHIFU wurde in verschiedenen Gewebetypen getestet und kann für eine Vielzahl von Temperaturbehandlungen eingesetzt werden, von der leichten HT bis zur Ablation, sowie klinisch zur erfolgreichen Behandlung schmerzhafter Knochenmetastasen¹⁸. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass HT Tumorzytotoxizität verursacht, die Proteinexpression moduliert und die Immunantwort in der Tumormikroumgebung verändert 19,20,21,22. In einer Studie wurde eine milde HT mit TLD, gefolgt von einer Ablation mit MRgHIFU, in einem synergetischen R1-Rattenmodell²³ kombiniert, was zu einer Nekrose im Tumorkern und einer Medikamentenabgabe in die Peripherie führte. Traditionell wurde die Strahlentherapie als Zusatztherapie eingesetzt, um Tumorzellen zu schädigen und das lokale Wiederauftreten der Krankheit zu verringern. Seine Verwendung ist jedoch durch die lebenslange Dosierung und den Schaden außerhalb des Ziels^{begrenzt 1}. Daher ist HT insofern einzigartig, als es einige der gleichen Wirkungen ohne die gleichen Toxizitäten oder Einschränkungen verursachen kann.

Zu den präklinischen Tiermodellen für RMS gehören syngene immunkompetente Modelle und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX) in immungeschwächten Wirten. Die immungeschwächten Modelle ermöglichen zwar das Wachstum der menschlichen Tumore, aber ihnen fehlt die geeignete Tumormikroumgebung und sie sind in ihrer Fähigkeit, die Immunantwort zu untersuchen, eingeschränkt²⁴. Die FGFR4-aktivierende Mutation ist ein vielversprechender Marker für eine schlechte Prognose und ein potenzielles therapeutisches Ziel bei adulter und pädiatrischer RMS ^1,25. In den syngenen RMS-Modellen, die im Gladdy-Labor entwickelt wurden, sind die Tumore in der Lage, in einem immunkompetenten Wirt zu wachsen, der eine angeborene und adaptive Immunantwort auf den Tumor entwickelt²⁶. Da HT die Immunantwort beeinflusst, ist die Beobachtung der Veränderung der murinen Immunantwort ein wertvoller Vorteil dieses Tumormodells. Um sowohl die Tumorantwort auf TLD im Vergleich zu FD als auch die Veränderung der Immunantwort des Tumors sowohl auf Chemotherapie als auch auf HT zu testen, wurde ein Protokoll zur Behandlung von syngenen murinen RMS-Tumoren in vivo mit MRgHIFU und TLD entwickelt und eingesetzt, was im Fokus dieser Studie steht.

Protocol

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflegeausschüssen mit genehmigten Tierverwendungsprotokollen unter einem beaufsichtigenden Tierarzt in den Tierversuchseinrichtungen des Centre for Phenogenomics (TCP) und des University Health Network (UHN) Animal Resource Centre (ARC) durchgeführt. Alle Verfahren, mit Ausnahme des MRgHIFU, an denen die Tiere beteiligt waren, wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt, um die Exposition der Tiere gegenüber der Außenluft oder anfällige Inf…

Representative Results

Mit Hilfe des MRgHIFU-generierten Hyperthermie-Protokolls konnten die Tumoren in der Hintergliedmaße für die Dauer der Behandlung konstant auf die gewünschte eingestellte Temperatur erhitzt werden (Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Behandlung, 10 oder 20 min, n = 65). Um eine Behandlung als erfolgreich zu betrachten, musste der ROI während der gesamten Behandlung über 39 °C gehalten werden, mit einer Schwankung von <6 °C während der gesamten Behandlung und ohne Erwärmung des Of…

Discussion

Das hier entwickelte Protokoll wurde verwendet, um Tumore der Hintergliedmaßen unter Verwendung von MRgHIFU für eine milde HT-Behandlung zu behandeln und verkapselte Wirkstoffe aus Liposomen in vivo freizusetzen. Während der Pilotstudie wurden mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll festgestellt, und die Optimierung dieser kritischen Schritte führte zu einem verbesserten Behandlungserfolg gegenüber der Pilotstudie. Zuerst werden die Haare an der zu beschallenden Stelle vollständig entfernt. Jeder Ga…

Materials

1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08