אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית
Summary
בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בדיקה מבוססת היטב לכימות נזק לדנ”א. עם זאת, ניקוד הבדיקה באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה ידנית או ניתוח תמונה מבוסס תכונות הוא מייגע ומאתגר. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לפיתוח מודל בינה מלאכותית כדי להבקיע את מבחן MN באמצעות נתוני ציטומטריה של זרימת הדמיה.
Abstract
בדיקת המיקרוגרעין (MN) משמשת ברחבי העולם גופים רגולטוריים להערכת רעילות גנטית של כימיקלים. הבדיקה יכולה להתבצע בשתי דרכים: על ידי ניקוד MN בתאים בינוקליים חד-פעמיים מחולקים, חסומים ציטוקינזיס או תאים חד-גרעיניים מחולקים במלואם. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופ אור היה שיטת תקן הזהב כדי להבקיע את המבחן, אבל זה מייגע וסובייקטיבי. ציטומטריית זרימה שימשה בשנים האחרונות כדי לדרג את הבדיקה, אך היא מוגבלת על ידי חוסר היכולת לאשר חזותית היבטים מרכזיים של תמונות תאיות. ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) משלבת לכידת תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח תמונה אוטומטי, ויושמה בהצלחה כדי לרכוש במהירות תמונות של כל אירועי המפתח במבחן MN ולניקוד שלהם. לאחרונה, הוכח כי שיטות בינה מלאכותית (AI) המבוססות על רשתות עצביות קונבולוציוניות יכולות לשמש כדי לדרג נתוני בדיקת MN שנרכשו על ידי IFC. מאמר זה מתאר את כל השלבים לשימוש בתוכנת AI כדי ליצור מודל למידה עמוקה כדי לדרג את כל אירועי המפתח וליישם מודל זה כדי להבקיע נתונים נוספים באופן אוטומטי. תוצאות מודל הלמידה העמוקה של AI משתוות היטב למיקרוסקופיה ידנית, ולכן מאפשרות ניקוד אוטומטי לחלוטין של בדיקת MN על ידי שילוב IFC ו- AI.
Introduction
בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בסיסית בטוקסיקולוגיה גנטית כדי להעריך נזק לדנ”א בפיתוח קוסמטיקה, תרופות וכימיקלים לשימוש אנושי 1,2,3,4. מיקרו-גרעינים נוצרים מכרומוזומים שלמים או מקטעי כרומוזומים שאינם משתלבים בגרעין לאחר החלוקה ומתעבים לגופים קטנים ועגולים נפרדים מהגרעין. לפיכך, MN יכול לשמש כנקודת קצה לכימות נזק לדנ”א בבדיקת גנוטוקסיות1.
השיטה המועדפת לכימות MN היא בתוך תאים בינוקלים שחולקו פעם אחת (BNCs) על ידי חסימת חלוקה באמצעות Cytochalasin-B (Cyt-B). בגרסה זו של הבדיקה, ציטוטוקסיות מוערכת גם על ידי ניקוד תאים מונונוקלציה (MONO) ו polynucleated (POLY). הבדיקה יכולה להתבצע גם על ידי ניקוד MN בתאי MONO לא חסומים, שהוא מהיר וקל יותר להבקיע, כאשר ציטוטוקסיות מוערכת באמצעות ספירת תאים לפני ואחרי חשיפה כדי להעריך התפשטות 5,6.
ניקוד פיזי של הבדיקה בוצע באופן היסטורי באמצעות מיקרוסקופיה ידנית, שכן זה מאפשר אישור חזותי של כל אירועי המפתח. עם זאת, מיקרוסקופ ידני הוא מאתגר וסובייקטיבי1. כך פותחו טכניקות אוטומטיות, כולל סריקת שקופיות במיקרוסקופ וציטומטריית זרימה, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה. בעוד ששיטות סריקת שקופיות מאפשרות להציג באופן חזותי אירועי מפתח, יש ליצור שקופיות בצפיפות תאים אופטימלית, דבר שעשוי להיות קשה להשגה. בנוסף, טכניקה זו לעתים קרובות חסר ויזואליזציה ציטופלזמית, אשר יכול לסכן את הניקוד של MONO ו POLY תאים 7,8. בעוד ציטומטריית זרימה מציעה לכידת נתונים בתפוקה גבוהה, התאים חייבים להיות lysed, ובכך לא לאפשר את השימוש בצורת Cyt-B של הבדיקה. בנוסף, כטכניקה שאינה הדמיה, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית אינה מספקת אימות חזותי של אירועי מפתח 9,10.
לכן, ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) נחקרה לביצוע בדיקת MN. ImageStreamX Mk II משלב את המהירות והחוסן הסטטיסטי של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה במערכת אחת11. הוכח כי באמצעות IFC, ניתן לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של כל אירועי המפתח ולהבקיע באופן אוטומטי באמצעות טכניקות מבוססות תכונות 12,13 או בינה מלאכותית (AI) 14,15. על ידי שימוש ב- IFC לביצוע בדיקת MN, הניקוד האוטומטי של תאים רבים יותר בהשוואה למיקרוסקופ בפרק זמן קצר יותר הוא בר השגה.
עבודה זו חורגת מתהליך עבודה של ניתוח תמונה16 שתואר קודם לכן ודנה בכל השלבים הנדרשים לפיתוח ואימון מודל של Random Forest (RF) ו/או רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) באמצעות תוכנת Amnis AI (להלן “תוכנת AI”). כל השלבים הדרושים מתוארים, כולל אכלוס נתוני אמת קרקעית באמצעות כלי תיוג בסיוע AI, פרשנות של תוצאות אימון המודל, ויישום המודל לסיווג נתונים נוספים, המאפשר חישוב של גנוטוקסיות וציטוטוקסיות15.
Protocol
Representative Results
Discussion
העבודה המוצגת כאן מתארת את השימוש באלגוריתמים של למידה עמוקה כדי להפוך את הניקוד של מבחן MN לאוטומטי. מספר פרסומים אחרונים הראו כי כלים אינטואיטיביים ואינטראקטיביים מאפשרים יצירת מודלים של למידה עמוקה לניתוח נתוני תמונה ללא צורך בידע חישובי מעמיק18,19. הפרוט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
