इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस का उपयोग करके माइक्रोन्यूक्लियस परख का स्वचालन
Summary
माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख डीएनए क्षति को मापने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित परीक्षण है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोस्कोपी या फीचर-आधारित छवि विश्लेषण जैसी पारंपरिक तकनीकों का उपयोग करके परख स्कोर करना श्रमसाध्य और चुनौतीपूर्ण है। यह पेपर इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री डेटा का उपयोग करके एमएन परख को स्कोर करने के लिए एक कृत्रिम बुद्धि मॉडल विकसित करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख का उपयोग दुनिया भर में नियामक निकायों द्वारा आनुवंशिक विषाक्तता के लिए रसायनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। परख को दो तरीकों से किया जा सकता है: एक बार विभाजित, साइटोकिनेसिस-अवरुद्ध द्वि-नाभिक कोशिकाओं या पूरी तरह से विभाजित मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं में एमएन स्कोर करके। ऐतिहासिक रूप से, प्रकाश माइक्रोस्कोपी परख को स्कोर करने के लिए स्वर्ण मानक विधि रही है, लेकिन यह श्रमसाध्य और व्यक्तिपरक है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग हाल के वर्षों में परख को स्कोर करने के लिए किया गया है, लेकिन सेलुलर इमेजरी के प्रमुख पहलुओं की नेत्रहीन पुष्टि करने में असमर्थता से सीमित है। इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) उच्च-थ्रूपुट छवि कैप्चर और स्वचालित छवि विश्लेषण को जोड़ती है, और एमएन परख में सभी प्रमुख घटनाओं की इमेजरी को तेजी से प्राप्त करने और स्कोर करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि संक्रामक तंत्रिका नेटवर्क पर आधारित कृत्रिम बुद्धि (एआई) विधियों का उपयोग आईएफसी द्वारा अधिग्रहित एमएन परख डेटा को स्कोर करने के लिए किया जा सकता है। यह पेपर सभी प्रमुख घटनाओं को स्कोर करने के लिए एक गहरी शिक्षा मॉडल बनाने के लिए एआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करने और इस मॉडल को स्वचालित रूप से अतिरिक्त डेटा स्कोर करने के लिए लागू करने के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है। एआई डीप लर्निंग मॉडल के परिणाम मैनुअल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करते हैं, इसलिए आईएफसी और एआई के संयोजन से एमएन परख के पूरी तरह से स्वचालित स्कोरिंग को सक्षम करते हैं।
Introduction
माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) परख मानव उपयोगके लिए सौंदर्य प्रसाधन, फार्मास्यूटिकल्स और रसायनों के विकास में डीएनए क्षति का मूल्यांकन करने के लिए आनुवंशिक विष विज्ञान में मौलिक है। माइक्रोन्यूक्लियस पूरे गुणसूत्रों या गुणसूत्र टुकड़ों से बनते हैं जो विभाजन के बाद नाभिक में शामिल नहीं होते हैं और नाभिक से अलग छोटे, गोलाकार निकायों में संघनित होते हैं। इस प्रकार, एमएन का उपयोग जीनोटॉक्सिसिटी परीक्षण 1 में डीएनए क्षति को मापने के लिए एक समापन बिंदुके रूप में किया जा सकता है।
एमएन की मात्रा निर्धारित करने का पसंदीदा तरीका साइटोचलासिन-बी (साइट-बी) का उपयोग करके विभाजन को अवरुद्ध करके एक बार विभाजित द्विराष्ट्रीय कोशिकाओं (बीएनसी) के भीतर है। परख के इस संस्करण में, साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन मोनोन्यूक्लिएटेड (मोनो) और पॉलीन्यूक्लिएटेड (पॉली) कोशिकाओं को स्कोर करके भी किया जाता है। परख को अनब्लॉक्ड मोनो कोशिकाओं में एमएन स्कोर करके भी किया जा सकता है, जो स्कोर करने में तेज और आसान है, प्रसार 5,6 का आकलन करने के लिए प्री-और पोस्ट-एक्सपोज़र सेल काउंट का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया जा रहा है।
परख का भौतिक स्कोरिंग ऐतिहासिक रूप से मैनुअल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया गया है, क्योंकि यह सभी प्रमुख घटनाओं की दृश्य पुष्टि की अनुमति देता है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण और व्यक्तिपरक है। इस प्रकार, माइक्रोस्कोप स्लाइड स्कैनिंग और फ्लो साइटोमेट्री सहित स्वचालित तकनीकों को विकसित किया गया है, जिनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और सीमाएं हैं। जबकि स्लाइड-स्कैनिंग विधियां प्रमुख घटनाओं को देखने की अनुमति देती हैं, स्लाइड्स को इष्टतम सेल घनत्व पर बनाया जाना चाहिए, जिसे प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, इस तकनीक में अक्सर साइटोप्लाज्मिक विज़ुअलाइज़ेशन का अभाव होता है, जो मोनो और पॉली कोशिकाओं7,8 के स्कोरिंग से समझौता कर सकता है। जबकि फ्लो साइटोमेट्री उच्च-थ्रूपुट डेटा कैप्चर प्रदान करता है, कोशिकाओं को लाइस किया जाना चाहिए, इस प्रकार परख के साइट-बी रूप के उपयोग की अनुमति नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक गैर-इमेजिंग तकनीक के रूप में, पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री प्रमुख घटनाओं 9,10 का दृश्य सत्यापन प्रदान नहीं करता है।
इसलिए, एमएन परख करने के लिए इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) की जांच की गई है। इमेजस्ट्रीमएक्स एमके II एक एकल प्रणाली11 में माइक्रोस्कोपी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षमताओं के साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति और सांख्यिकीय मजबूती को जोड़ती है। यह दिखाया गया है कि आईएफसी का उपयोग करके, सभी प्रमुख घटनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजरी को फीचर-आधारित12,13 या कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) तकनीक14,15 का उपयोग करके कैप्चर और स्वचालित रूप से स्कोर किया जा सकता है। एमएन परख करने के लिए आईएफसी का उपयोग करके, कम समय में माइक्रोस्कोपी की तुलना में कई और कोशिकाओं का स्वचालित स्कोरिंग प्राप्त करने योग्य है।
यह काम पहले वर्णित छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो16 से विचलित होता है और एमनिस एआई सॉफ्टवेयर (अब से “एआई सॉफ्टवेयर” के रूप में संदर्भित) का उपयोग करके रैंडम फॉरेस्ट (आरएफ) और / या कन्वोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) मॉडल को विकसित करने और प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों पर चर्चा करता है। सभी आवश्यक चरणों का वर्णन किया गया है, जिसमें एआई-असिस्टेड टैगिंग टूल का उपयोग करके जमीनी सच्चाई डेटा को पॉप्युलेट करना, मॉडल प्रशिक्षण परिणामों की व्याख्या, और अतिरिक्त डेटा को वर्गीकृत करने के लिए मॉडल का अनुप्रयोग, जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी15 की गणना की अनुमति देना शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत कार्य एमएन परख के स्कोरिंग को स्वचालित करने के लिए गहन शिक्षण एल्गोरिदम के उपयोग का वर्णन करता है। हाल के कई प्रकाशनों से पता चला है कि सहज ज्ञान युक्त, इंटरैक्टिव उपकरण गहन कम्प्यूटेशनल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
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