Автоматизация анализа микроядер с помощью визуализационной проточной цитометрии и искусственного интеллекта
Summary
Анализ микроядра (MN) является хорошо зарекомендовавшим себя тестом для количественной оценки повреждения ДНК. Однако оценка анализа с использованием традиционных методов, таких как ручная микроскопия или анализ изображений на основе признаков, является трудоемкой и сложной. В этой статье описывается методология разработки модели искусственного интеллекта для оценки анализа MN с использованием данных проточной цитометрии визуализации.
Abstract
Анализ микроядра (MN) используется регулирующими органами во всем мире для оценки химических веществ на предмет генетической токсичности. Анализ может быть выполнен двумя способами: путем оценки MN в однажды разделенных, заблокированных цитокинезом бинуклеированных клетках или полностью разделенных моноядерных клетках. Исторически сложилось так, что световая микроскопия была золотым стандартом для оценки анализа, но она трудоемка и субъективна. Проточная цитометрия использовалась в последние годы для оценки анализа, но ограничена неспособностью визуально подтвердить ключевые аспекты клеточных изображений. Визуализирующая проточная цитометрия (IFC) сочетает в себе высокопроизводительный захват изображений и автоматический анализ изображений и успешно применяется для быстрого получения изображений и оценки всех ключевых событий в анализе MN. Недавно было продемонстрировано, что методы искусственного интеллекта (ИИ), основанные на сверточных нейронных сетях, могут быть использованы для оценки данных анализа MN, полученных IFC. В этом документе описываются все шаги по использованию программного обеспечения ИИ для создания модели глубокого обучения для оценки всех ключевых событий и применения этой модели для автоматической оценки дополнительных данных. Результаты модели глубокого обучения ИИ хорошо сравниваются с ручной микроскопией, что позволяет полностью автоматизировать оценку анализа MN путем объединения IFC и AI.
Introduction
Анализ микроядра (MN) имеет основополагающее значение в генетической токсикологии для оценки повреждения ДНК при разработке косметики, фармацевтических препаратов и химических веществ для использования человеком 1,2,3,4. Микроядра образуются из целых хромосом или фрагментов хромосом, которые не включаются в ядро после деления и конденсируются в небольшие круглые тела, отделенные от ядра. Таким образом, MN можно использовать в качестве конечной точки для количественной оценки повреждения ДНК при тестировании на генотоксичность1.
Предпочтительный метод количественной оценки MN заключается в некогда разделенных бинуклеированных клетках (BNC) путем блокирования деления с использованием цитохалазина-B (Cyt-B). В этой версии анализа цитотоксичность также оценивается путем оценки моноядерных (MONO) и полиядерных (POLY) клеток. Анализ также может быть выполнен путем оценки MN в незаблокированных клетках MONO, что быстрее и легче набрать, при этом цитотоксичность оценивается с использованием количества клеток до и после воздействия для оценки пролиферации 5,6.
Физический подсчет результатов анализа исторически проводился с помощью ручной микроскопии, поскольку это позволяет визуально подтверждать все ключевые события. Однако ручная микроскопия сложна и субъективна1. Таким образом, были разработаны автоматизированные методы, в том числе сканирование предметных стекол микроскопа и проточная цитометрия, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения. В то время как методы сканирования слайдов позволяют визуализировать ключевые события, слайды должны создаваться с оптимальной плотностью ячеек, чего может быть трудно достичь. Кроме того, в этом методе часто отсутствует цитоплазматическая визуализация, что может поставить под угрозу оценку клеток MONO и POLY 7,8. В то время как проточная цитометрия обеспечивает высокопроизводительный сбор данных, клетки должны быть лизированы, что не позволяет использовать форму анализа Cyt-B. Кроме того, традиционная проточная цитометрия, не являющаяся методом визуализации, не обеспечивает визуальной проверки ключевых событий 9,10.
Поэтому для проведения анализа MN была исследована визуализирующая проточная цитометрия (IFC). ImageStreamX Mk II сочетает в себе скорость и статистическую надежность обычной проточной цитометрии с возможностями визуализации с высоким разрешением микроскопии в одной системе11. Было показано, что с помощью IFC можно захватывать и автоматически оценивать изображения всех ключевых событий с высоким разрешением с использованием методов 12,13 на основе функций 12,13 или искусственного интеллекта (ИИ) 14,15. Используя IFC для проведения анализа MN, можно получить автоматическую оценку гораздо большего количества клеток по сравнению с микроскопией за более короткий промежуток времени.
Эта работа отличается от ранее описанного рабочего процессаанализа изображений 16 и обсуждает все шаги, необходимые для разработки и обучения модели случайного леса (RF) и/или сверточной нейронной сети (CNN) с использованием программного обеспечения Amnis AI (далее именуемого «программное обеспечение AI»). Описаны все необходимые шаги, включая заполнение наземных достоверных данных с помощью инструментов маркировки с помощью ИИ, интерпретацию результатов обучения модели и применение модели для классификации дополнительных данных, что позволяет рассчитать генотоксичность и цитотоксичность15.
Protocol
Representative Results
Discussion
В представленной здесь работе описывается использование алгоритмов глубокого обучения для автоматизации скоринга анализа MN. Несколько недавних публикаций показали, что интуитивно понятные интерактивные инструменты позволяют создавать модели глубокого обучения для анализа данных ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
