Automação do Ensaio de Micronúcleos Utilizando Imagem por Citometria de Fluxo e Inteligência Artificial

Summary

O ensaio de micronúcleo (MN) é um teste bem estabelecido para quantificar danos ao DNA. No entanto, pontuar o ensaio usando técnicas convencionais, como microscopia manual ou análise de imagem baseada em recursos, é trabalhoso e desafiador. Este artigo descreve a metodologia para desenvolver um modelo de inteligência artificial para pontuar o ensaio de MN usando dados de citometria de fluxo de imagem.

Abstract

O ensaio de micronúcleo (MN) é usado mundialmente por órgãos reguladores para avaliar produtos químicos quanto à toxicidade genética. O ensaio pode ser realizado de duas maneiras: pontuando MN em células binucleadas bloqueadas por citocinese ou células mononucleadas totalmente divididas. Historicamente, a microscopia óptica tem sido o método padrão-ouro para pontuar o ensaio, mas é trabalhosa e subjetiva. A citometria de fluxo tem sido usada nos últimos anos para pontuar o ensaio, mas é limitada pela incapacidade de confirmar visualmente aspectos-chave da imagética celular. A citometria de fluxo por imagem (IFC) combina captura de imagem de alto rendimento e análise automatizada de imagens, e tem sido aplicada com sucesso para adquirir rapidamente imagens e pontuar todos os eventos-chave no ensaio de MN. Recentemente, foi demonstrado que métodos de inteligência artificial (IA) baseados em redes neurais convolucionais podem ser usados para pontuar dados de ensaios de MN adquiridos por IFC. Este documento descreve todas as etapas para usar o software de IA para criar um modelo de aprendizado profundo para pontuar todos os eventos-chave e aplicar esse modelo para pontuar automaticamente dados adicionais. Os resultados do modelo de aprendizagem profunda de IA se comparam bem à microscopia manual, permitindo assim a pontuação totalmente automatizada do ensaio MN combinando IFC e IA.

Introduction

O ensaio de micronúcleos (NM) é fundamental na toxicologia genética para avaliar danos ao DNA no desenvolvimento de cosméticos, fármacos e produtos químicos para uso humano 1,2,3,4. Os micronúcleos são formados a partir de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos que não se incorporam ao núcleo após a divisão e se condensam em pequenos corpos circulares separados do núcleo. Assim, o NM pode ser usado como um desfecho para quantificar danos ao DNA em testes de genotoxicidade¹.

O método preferido para quantificar MN é dentro de células binucleadas (BNCs) divididas uma vez por bloqueio de divisão usando Citocalasina-B (Cyt-B). Nesta versão do ensaio, a citotoxicidade também é avaliada por meio da pontuação de células mononucleadas (MONO) e polinucleadas (POLY). O ensaio também pode ser realizado por meio da pontuação de MN em células MONO desbloqueadas, o que é mais rápido e fácil de pontuar, com a citotoxicidade sendo avaliada usando contagens de células pré e pós-exposição para avaliar a proliferação ^5,6.

A pontuação física do ensaio tem sido historicamente realizada por microscopia manual, uma vez que permite a confirmação visual de todos os eventos-chave. Entretanto, a microscopia manual é desafiadora e^subjetiva1. Assim, técnicas automatizadas têm sido desenvolvidas, incluindo varredura de lâminas ao microscópio e citometria de fluxo, cada uma com suas vantagens e limitações. Embora os métodos de varredura de slides permitam que eventos-chave sejam visualizados, os slides devem ser criados na densidade de célula ideal, o que pode ser difícil de alcançar. Além disso, essa técnica muitas vezes não tem visualização citoplasmática, o que pode comprometer a pontuação das células MONO e POLY ^7,8. Embora a citometria de fluxo ofereça captura de dados de alto rendimento, as células devem ser lisadas, não permitindo o uso da forma Cyt-B do ensaio. Além disso, por ser uma técnica não imaginológica, a citometria de fluxo convencional não fornece validação visual de eventos-chave ^9,10.

Portanto, a citometria de fluxo por imagem (CIF) tem sido investigada para realizar o ensaio de NM. O ImageStream^X Mk II combina a velocidade e a robustez estatística da citometria de fluxo convencional com os recursos de imagem de alta resolução da microscopia em um único sistema¹¹. Foi demonstrado que, usando IFC, imagens de alta resolução de todos os eventos-chave podem ser capturadas e pontuadas automaticamente usando técnicas baseadas em recursos 12,13 ou inteligência artificial (IA) ^14,15. Usando IFC para realizar o ensaio de MN, a pontuação automática de muito mais células em comparação com a microscopia em um período mais curto de tempo é alcançável.

Este trabalho se desvia de um fluxo de trabalho de análise de imagens descrito anteriormente¹⁶ e discute todas as etapas necessárias para desenvolver e treinar um modelo de Floresta Aleatória (RF) e/ou rede neural convolucional (CNN) usando o software Amnis AI (doravante referido como “software de IA”). Todas as etapas necessárias são descritas, incluindo o preenchimento de dados de verdade terrestres usando ferramentas de marcação assistidas por IA, interpretação dos resultados do treinamento do modelo e aplicação do modelo para classificar dados adicionais, permitindo o cálculo de genotoxicidade e citotoxicidade¹⁵.

Protocol

1. Aquisição de dados por citometria de fluxo por imagem NOTA: Consulte Rodrigues et al.16 com as seguintes modificações, observando que as regiões de aquisição usando IFC podem precisar ser modificadas para a captura ideal da imagem: Para o método não-Cyt-B, realizar uma contagem de células usando um contador de células disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) em c…

Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para usar o software de IA para criar um modelo para o ensaio MN. O usuário carrega os arquivos .daf desejados no software de IA e, em seguida, atribui objetos às classes de modelo verdade terrestre usando os algoritmos de marcação de cluster assistido por IA (Figura 2) e de previsão (Figura 3). Uma vez que todas as classes de modelo verdade terrestre tenham sido preenchidas com objetos suf…

Discussion

O trabalho aqui apresentado descreve o uso de algoritmos de aprendizagem profunda para automatizar a pontuação do ensaio MN. Diversas publicações recentes têm demonstrado que ferramentas intuitivas e interativas permitem a criação de modelos de deep learning para analisar dados de imagens sem a necessidade de conhecimento computacional aprofundado^18,19. O protocolo descrito neste trabalho usando um pacote de software orientado por interface de usuário foi…

Materials

15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Cleanser – Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546931	Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter	MilliporeSigma	CLS430769	0.22 µm filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B	MilliporeSigma	14930-96-2	5 mg bottle
Debubbler – 70% Isopropanol	MilliporeSigma	1.3704	Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	MilliporeSigma	67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Free
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell Analyzer	Luminex	0500-3115	A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/mL solution
Mannitol	MilliporeSigma	69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC – ImageStreamX Mark II	Luminex, a DiaSorin company	100220	A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.
MIFC analysis software – IDEAS	Luminex, a DiaSorin company	100220	"Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software – INSPIRE	Luminex, a DiaSorin company	100220	"Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI software	Luminex, a DiaSorin company	100221	"AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data
Mitomycin C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA Mixture 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X	Gibco	15070063
Potassium Chloride (KCl)	MilliporeSigma	P9541
Rinse – Ultrapure water or deionized water	NA	NA	Use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x	HyClone	SH30027.01
Sheath – PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Sterile water	HyClone	SH30529.01
Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite	VWR	JT9416-1	This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
T25 flask	Falcon	353109
T75 flask	Falcon	353136
TK6 cells	MilliporeSigma	95111735