Automatisation du test du micronoyau à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie et de l’intelligence artificielle
Summary
Le test du micronoyau (MN) est un test bien établi pour quantifier les dommages à l’ADN. Cependant, la notation du test à l’aide de techniques conventionnelles telles que la microscopie manuelle ou l’analyse d’images basée sur des caractéristiques est laborieuse et difficile. Cet article décrit la méthodologie pour développer un modèle d’intelligence artificielle pour noter le test MN à l’aide de données de cytométrie de flux d’imagerie.
Abstract
Le test du micronoyau (MN) est utilisé dans le monde entier par les organismes de réglementation pour évaluer la toxicité génétique des produits chimiques. Le test peut être effectué de deux manières: en marquant MN dans des cellules binucléées une fois divisées, bloquées par cytocinèse ou des cellules mononucléées entièrement divisées. Historiquement, la microscopie optique a été la méthode de référence pour noter le test, mais elle est laborieuse et subjective. La cytométrie en flux a été utilisée ces dernières années pour évaluer le test, mais elle est limitée par l’incapacité de confirmer visuellement les aspects clés de l’imagerie cellulaire. La cytométrie de flux d’imagerie (IFC) combine la capture d’images à haut débit et l’analyse automatisée des images, et a été appliquée avec succès pour acquérir rapidement des images et marquer tous les événements clés du test MN. Récemment, il a été démontré que les méthodes d’intelligence artificielle (IA) basées sur des réseaux neuronaux convolutifs peuvent être utilisées pour évaluer les données de test MN acquises par IFC. Ce document décrit toutes les étapes d’utilisation d’un logiciel d’IA pour créer un modèle d’apprentissage en profondeur afin de noter tous les événements clés et d’appliquer ce modèle pour noter automatiquement des données supplémentaires. Les résultats du modèle d’apprentissage profond de l’IA se comparent bien à la microscopie manuelle, permettant ainsi une notation entièrement automatisée du test MN en combinant IFC et IA.
Introduction
Le test du micronoyau (MN) est fondamental en toxicologie génétique pour évaluer les dommages à l’ADN dans le développement de cosmétiques, de produits pharmaceutiques et de produits chimiques à usage humain 1,2,3,4. Les micronoyaux sont formés à partir de chromosomes entiers ou de fragments de chromosomes qui ne s’incorporent pas dans le noyau après la division et se condensent en petits corps circulaires séparés du noyau. Ainsi, MN peut être utilisé comme critère d’évaluation pour quantifier les dommages à l’ADN dans les essais de génotoxicité1.
La méthode préférée pour quantifier la MN est dans les cellules binucléées (BNC) une fois divisées en bloquant la division à l’aide de la cytochalasine-B (Cyt-B). Dans cette version du test, la cytotoxicité est également évaluée en marquant les cellules mononucléées (MONO) et polynucléées (POLY). Le test peut également être effectué en marquant MN dans les cellules MONO non bloquées, ce qui est plus rapide et plus facile à noter, la cytotoxicité étant évaluée à l’aide du nombre de cellules pré- et post-exposition pour évaluer la prolifération 5,6.
La notation physique du test a toujours été effectuée par microscopie manuelle, car cela permet une confirmation visuelle de tous les événements clés. Cependant, la microscopie manuelle est difficile et subjective1. Ainsi, des techniques automatisées ont été développées, y compris le balayage de lames de microscope et la cytométrie en flux, chacune avec ses propres avantages et limites. Alors que les méthodes de balayage des lames permettent de visualiser les événements clés, les lames doivent être créées à une densité cellulaire optimale, ce qui peut être difficile à réaliser. De plus, cette technique manque souvent de visualisation cytoplasmique, ce qui peut compromettre la notation des cellules MONO et POLY 7,8. Bien que la cytométrie en flux offre une capture de données à haut débit, les cellules doivent être lysées, ce qui ne permet pas l’utilisation de la forme Cyt-B du test. De plus, en tant que technique non d’imagerie, la cytométrie en flux conventionnelle ne permet pas de valider visuellement les événements clés 9,10.
Par conséquent, la cytométrie de flux d’imagerie (IFC) a été étudiée pour effectuer le test MN. L’ImageStreamX Mk II combine la vitesse et la robustesse statistique de la cytométrie en flux conventionnelle avec les capacités d’imagerie haute résolution de la microscopie dans un seul système11. Il a été démontré qu’en utilisant IFC, l’imagerie haute résolution de tous les événements clés peut être capturée et notée automatiquement à l’aide de techniques basées sur les caractéristiques 12,13 ou d’intelligence artificielle (IA) 14,15. En utilisant IFC pour effectuer le test MN, la notation automatique de beaucoup plus de cellules par rapport à la microscopie dans un laps de temps plus court est réalisable.
Ce travail s’écarte d’un flux de travail d’analyse d’imagesdécrit précédemment 16 et traite de toutes les étapes nécessaires pour développer et entraîner un modèle de forêt aléatoire (RF) et / ou de réseau neuronal convolutif (CNN) à l’aide du logiciel Amnis AI (ci-après dénommé « logiciel d’IA »). Toutes les étapes nécessaires sont décrites, y compris le remplissage des données de réalité sur le terrain à l’aide d’outils de marquage assistés par l’IA, l’interprétation des résultats de formation du modèle et l’application du modèle pour classer des données supplémentaires, permettant de calculer la génotoxicité et la cytotoxicité15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le travail présenté ici décrit l’utilisation d’algorithmes d’apprentissage profond pour automatiser la notation du test MN. Plusieurs publications récentes ont montré que des outils intuitifs et interactifs permettent la création de modèles d’apprentissage profond pour analyser les données d’images sans avoir besoin de connaissances informatiques approfondies18,19. Le protocole décrit dans ce travail à l’aide d’un progiciel piloté par int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
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