Automazione del test del micronucleo mediante citometria a flusso di imaging e intelligenza artificiale
Summary
Il test del micronucleo (MN) è un test ben consolidato per quantificare il danno al DNA. Tuttavia, la valutazione del test utilizzando tecniche convenzionali come la microscopia manuale o l’analisi delle immagini basata sulle caratteristiche è laboriosa e impegnativa. Questo articolo descrive la metodologia per sviluppare un modello di intelligenza artificiale per valutare il test MN utilizzando i dati di citometria a flusso di imaging.
Abstract
Il test del micronucleo (MN) viene utilizzato in tutto il mondo dagli organismi di regolamentazione per valutare le sostanze chimiche per la tossicità genetica. Il test può essere eseguito in due modi: segnando MN in cellule binucleate una volta divise, bloccate dalla citochinesi o cellule mononucleate completamente divise. Storicamente, la microscopia ottica è stata il metodo gold standard per valutare il test, ma è laboriosa e soggettiva. La citometria a flusso è stata utilizzata negli ultimi anni per valutare il test, ma è limitata dall’incapacità di confermare visivamente aspetti chiave delle immagini cellulari. La citometria a flusso di imaging (IFC) combina l’acquisizione di immagini ad alta produttività e l’analisi automatizzata delle immagini ed è stata applicata con successo per acquisire rapidamente immagini e valutare tutti gli eventi chiave nel test MN. Recentemente, è stato dimostrato che i metodi di intelligenza artificiale (AI) basati su reti neurali convoluzionali possono essere utilizzati per valutare i dati del saggio MN acquisiti da IFC. Questo documento descrive tutti i passaggi per utilizzare il software di intelligenza artificiale per creare un modello di deep learning per valutare tutti gli eventi chiave e applicare questo modello per assegnare automaticamente un punteggio a dati aggiuntivi. I risultati del modello di deep learning AI si confrontano bene con la microscopia manuale, consentendo quindi un punteggio completamente automatizzato del test MN combinando IFC e AI.
Introduction
Il test del micronucleo (MN) è fondamentale nella tossicologia genetica per valutare il danno al DNA nello sviluppo di cosmetici, prodotti farmaceutici e chimici per uso umano 1,2,3,4. I micronuclei sono formati da interi cromosomi o frammenti cromosomici che non si incorporano nel nucleo dopo la divisione e si condensano in piccoli corpi circolari separati dal nucleo. Pertanto, il MN può essere utilizzato come endpoint per quantificare il danno al DNA nei test di genotossicità1.
Il metodo preferito per quantificare la MN è all’interno di cellule binucleate (BNC) una volta divise bloccando la divisione utilizzando la citocalasina-B (Cyt-B). In questa versione del test, la citotossicità viene valutata anche segnando cellule mononucleate (MONO) e polinucleate (POLY). Il test può anche essere eseguito assegnando un punteggio MN in cellule MONO non bloccate, che è più veloce e più facile da valutare, con la citotossicità valutata utilizzando la conta cellulare pre e post-esposizione per valutare la proliferazione 5,6.
Il punteggio fisico del test è stato storicamente eseguito attraverso la microscopia manuale, poiché ciò consente la conferma visiva di tutti gli eventi chiave. Tuttavia, la microscopia manuale è impegnativa e soggettiva1. Pertanto, sono state sviluppate tecniche automatizzate, tra cui la scansione del vetrino da microscopio e la citometria a flusso, ognuna con i propri vantaggi e limiti. Mentre i metodi di scansione dei vetrini consentono di visualizzare gli eventi chiave, i vetrini devono essere creati con una densità di cella ottimale, che può essere difficile da raggiungere. Inoltre, questa tecnica spesso manca di visualizzazione citoplasmatica, che può compromettere il punteggio delle cellule MONO e POLY 7,8. Mentre la citometria a flusso offre un’acquisizione di dati ad alto rendimento, le cellule devono essere lisate, quindi non consentendo l’uso della forma Cyt-B del test. Inoltre, come tecnica non-imaging, la citometria a flusso convenzionale non fornisce la convalida visiva degli eventi chiave 9,10.
Pertanto, la citometria a flusso di imaging (IFC) è stata studiata per eseguire il test MN. ImageStreamX Mk II combina la velocità e la robustezza statistica della citometria a flusso convenzionale con le capacità di imaging ad alta risoluzione della microscopia in un unico sistema11. È stato dimostrato che utilizzando IFC, le immagini ad alta risoluzione di tutti gli eventi chiave possono essere catturate e valutate automaticamente utilizzando tecniche basate su funzionalità 12,13 o intelligenza artificiale (AI) 14,15. Utilizzando IFC per eseguire il test MN, è possibile ottenere il punteggio automatico di molte più cellule rispetto alla microscopia in un lasso di tempo più breve.
Questo lavoro si discosta da un flusso di lavoro di analisi delle immagini precedentemente descritto16 e discute tutti i passaggi necessari per sviluppare e addestrare un modello di foresta casuale (RF) e / o rete neurale convoluzionale (CNN) utilizzando il software Amnis AI (d’ora in poi denominato “software AI”). Vengono descritti tutti i passaggi necessari, tra cui il popolamento dei dati di verità sul terreno utilizzando strumenti di tagging assistiti dall’IA, l’interpretazione dei risultati dell’addestramento del modello e l’applicazione del modello per classificare dati aggiuntivi, consentendo il calcolo della genotossicità e della citotossicità15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il lavoro qui presentato descrive l’uso di algoritmi di deep learning per automatizzare il punteggio del test MN. Diverse pubblicazioni recenti hanno dimostrato che strumenti intuitivi e interattivi consentono la creazione di modelli di deep learning per analizzare i dati delle immagini senza la necessità di conoscenze computazionali approfondite18,19. Il protocollo descritto in questo lavoro utilizzando un pacchetto software basato sull’interfaccia utente è st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
