Контроль фракции частиц в микропористых отожженных каркасах частиц для 3D-культуры клеток
Summary
Минимизация изменчивости фракции частиц в зернистых каркасах облегчает воспроизводимые эксперименты. В данной работе описываются методы получения гранулированных каркасов с контролируемыми фракциями частиц для применения в тканевой инженерии in vitro .
Abstract
Микрогели являются строительными блоками каркасов микропористых отожженных частиц (MAP), которые служат платформой как для культуры клеток in vitro , так и для восстановления тканей in vivo . В этих зернистых каркасах врожденная пористость, создаваемая пустотным пространством между микрогелями, обеспечивает инфильтрацию и миграцию клеток. Контроль фракции пустоты и фракции частиц имеет решающее значение для проектирования каркасов MAP, поскольку пористость является биологически активным сигналом для клеток. Сферические микрогели могут быть сгенерированы на микрофлюидном устройстве для контролируемого размера и формы и впоследствии лиофилизированы с использованием методов, предотвращающих разрыв полимерной сети. При регидратации лиофилизированные микрогели приводят к контролируемым фракциям частиц в каркасах MAP. Реализация этих методов лиофилизации микрогелей привела к воспроизводимым исследованиям, показывающим влияние фракции частиц на диффузию макромолекул и распространение клеток. Следующий протокол будет охватывать изготовление, лиофилизацию и регидратацию микрогелей для контроля фракции частиц в каркасах MAP, а также отжиг микрогелей с помощью биоортогонального сшивания для 3D-культуры клеток in vitro.
Introduction
Каркасы микропористых отожженных частиц (MAP) представляют собой подкласс гранулированных материалов, в которых микрогелевые (мкгелевые) строительные блоки взаимосвязаны, образуя объемный, пористый каркас. Благодаря уникальной микроархитектуре этих зернистых каркасов врожденная пористость, создаваемая пустотным пространством между взаимосвязанными сферическими микрогелями, поддерживает ускоренную инфильтрацию клеток и миграцию1. Микрогелевые строительные блоки каркасов MAP могут быть изготовлены как из синтетических, так и из природных полимеров с химическими модификациями2. Методы, описанные здесь, специально подчеркивают использование микрогелей, состоящих из основы гиалуроновой кислоты (ГК), модифицированной функциональными ручками норборнена (NB). Функциональная ручка NB на полимере ГК поддерживает реакции щелочной химии для формирования микрогелей и связывания их вместе для создания каркасов MAP 3,4. Для связывания микрогелей вместе (т.е. отжига) были использованы многочисленные схемы, такие как ферментативная1, 5,6 на основе света и химия щелчка без добавок 3,7 реакции. Химия щелчков без добавок описана в этой работе с использованием обратного электронного потребления тетразин-норборнена Дильса-Альдера для взаимосвязи микрогелей HA-NB.
Для изготовления каркасов MAP пользователи сначала генерируют микрогелевые строительные блоки с использованием обратных эмульсий либо в периодических системах, либо в микрофлюидных устройствах, а также с помощью электрогидродинамического распыления, литографии или механической фрагментации2. Производство сферических микрогелей HA-NB было хорошо описано и ранее сообщалось с использованием как периодической эмульсии2, так и методов генерации микрофлюидных капель 8,9,10,11. В этой работе сферические микрогели HA-NB были сгенерированы на ориентированной на поток микрофлюидной платформе для контролируемого размера и формы, как описано ранее 8,9,10. После очистки микрогели существуют в водной суспензии и должны быть сконцентрированы, чтобы вызвать защемленное состояние. При защемлении микрогели проявляют свойства разжижения сдвига, которые позволяют им функционировать как инъекционные, заполняющие пространство материалы1. Одним из способов индуцирования застрявшего состояния является сушка микрогелей путем лиофилизации или сублимационной сушки, а затем последующая регидратация высушенного продукта в контролируемом объеме12. Альтернативно, избыточный буфер может быть удален из микрогелевой суспензии посредством центрифугирования над сетчатым фильтром или с ручным удалением буфера из гранулы микрогеля либо путем аспирации, либо с использованием абсорбирующего материала. Однако использование центрифугирования для сушки микрогелей может генерировать очень изменчивый диапазон фракций частиц и фракций пустот при изготовлении гранулированных каркасов12. Описаны способы лиофилизации микрогелей с использованием 70% IPA для микрогелей полиэтиленгликоля (PEG)13, фторированных масел для желатиновых метакрилоиловых (GelMa) микрогелей14 и 70% этанола для микрогелей HA12. Этот протокол выделяет методы сублимационной сушки сферических микрогелей ГК с использованием 70% этанола, стандартного лабораторного реагента, для сохранения исходных свойств микрогеля во время процесса сушки. Лиофилизированные микрогели ГК могут быть взвешены и регидратированы с заданными пользователем весовыми процентами для контроля конечных фракций частиц в каркасахMAP 12.
Заключительный этап формирования каркасов MAP основан на отжиге микрогелей для создания объемного, пористого каркаса1. Используя нативные компоненты внеклеточного матрикса и используя биоортогональные схемы отжига, каркасы MAP служат биосовместимой платформой как для клеточной культуры in vitro , так и для восстановления тканей in vivo 3. Благодаря этим подходам каркасы MAP могут быть изготовлены из строительных блоков HA-NB с определяемыми пользователем фракциями частиц для их использования в приложенияхтканевой инженерии 12. Следующий протокол описывает микрофлюидное производство микрогелей HA-NB с последующей лиофилизацией и регидратизацией для контроля фракции частиц в каркасах MAP. Наконец, этапы отжига микрогелей описаны с использованием биоортогональной химии для экспериментов in vitro с 3D-культурой клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Было показано, что микрофлюидное производство микрогелей HA-NB генерирует микрогели с более узким диапазоном распределения по размерам, чем периодическое производство эмульсий 3,9. Микрогели, описанные в этом протоколе, были сформулированы с использовани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Национальные институты здравоохранения, Национальные институты неврологических расстройств и инсульта (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) и Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (1R01AI152568). Эта работа была выполнена частично в Центре приборостроения общих материалов Университета Дьюка (SMIF), члене Нанотехнологической сети Исследовательского треугольника Северной Каролины (RTNN), которая поддерживается Национальным научным фондом (номер награды ECCS-2025064) в рамках Национальной скоординированной инфраструктуры нанотехнологий (NNCI). Авторы хотели бы поблагодарить бывшего постдока лаборатории доктора Лукаса Ширмера, а также Итана Никлоу за их помощь в создании 3D-печатного устройства для экспериментов с клеточными культурами.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
