Kontrolle der Partikelfraktion in mikroporös geglühten Partikelgerüsten für die 3D-Zellkultur
Summary
Die Minimierung der Variabilität der Partikelfraktion innerhalb von Granulatgerüsten erleichtert reproduzierbare Experimente. Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Erzeugung granularer Gerüste mit kontrollierten Partikelfraktionen für in vitro Tissue Engineering Anwendungen.
Abstract
Mikrogele sind die Bausteine von mikroporösen geglühten Partikeln (MAP)-Gerüsten, die als Plattform für die In-vitro-Zellkultur und die In-vivo-Gewebereparatur dienen. In diesen körnigen Gerüsten ermöglicht die angeborene Porosität, die durch den Hohlraum zwischen Mikrogelen erzeugt wird, die Zellinfiltration und -migration. Die Kontrolle der Hohlraumfraktion und der Partikelfraktion ist entscheidend für das MAP-Gerüstdesign, da die Porosität ein bioaktiver Hinweis für Zellen ist. Sphärische Mikrogele können auf einer mikrofluidischen Vorrichtung für kontrollierte Größe und Form erzeugt und anschließend gefriergetrocknet werden, wobei Methoden verwendet werden, die das Brechen des Polymernetzwerks verhindern. Bei der Rehydratation führen die lyophilisierten Mikrogele zu kontrollierten Partikelfraktionen in MAP-Gerüsten. Die Implementierung dieser Methoden zur Mikrogel-Lyophilisation hat zu reproduzierbaren Studien geführt, die den Einfluss der Partikelfraktion auf die Makromoleküldiffusion und Zellausbreitung zeigen. Das folgende Protokoll umfasst die Herstellung, Lyophilisierung und Rehydratation von Mikrogelen zur Kontrolle der Partikelfraktion in MAP-Gerüsten sowie das Glühen der Mikrogele durch bioorthogonale Vernetzung für die 3D-Zellkultur in vitro.
Introduction
Mikroporöse geglühte Partikel (MAP)-Gerüste sind eine Unterklasse von körnigen Materialien, in denen die Mikrogel-Bausteine (μgel) miteinander verbunden sind, um ein poröses Gerüst zu bilden. Mit der einzigartigen Mikroarchitektur dieser körnigen Gerüste unterstützt die angeborene Porosität, die durch den Hohlraum zwischen vernetztem sphärischem Mikrogel erzeugt wird, eine beschleunigte Zellinfiltration und -migration1. Die Mikrogel-Bausteine von MAP-Gerüsten können sowohl aus synthetischen als auch aus natürlichen Polymeren mit chemischen Modifikationen hergestelltwerden 2. Die hier beschriebenen Methoden heben insbesondere die Verwendung von Mikrogelen hervor, die aus einem Hyaluronsäure (HA)-Rückgrat bestehen, das mit funktionellen Norbornen (NB)-Griffen modifiziert ist. Der funktionelle NB-Griff am HA-Polymer unterstützt Klickchemiereaktionen zur Bildung von Mikrogelen und deren Verknüpfung zu MAP-Gerüsten 3,4. Zahlreiche Verfahren wurden verwendet, um die Mikrogele miteinander zu verbinden (d.h. Glühen), wie enzymatische1, lichtbasierte5,6 und additivfreie Klickchemie 3,7 Reaktionen. In dieser Arbeit wird die additivfreie Klickchemie beschrieben, wobei die inverse Tetrazin-Norbornen-Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Konjugation zur Verknüpfung der HA-NB-Mikrogele verwendet wird.
Zur Herstellung von MAP-Gerüsten erzeugen Anwender die Mikrogelbausteine zunächst unter Verwendung von Umkehremulsionen entweder in Batch-Systemen oder in mikrofluidischen Geräten sowie durch elektrohydrodynamisches Spritzen, Lithographie oder mechanische Fragmentierung2. Die Herstellung von sphärischen HA-NB-Mikrogelen wurde gut beschrieben und zuvor unter Verwendung von Batchemulsion2 und mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungstechniken 8,9,10,11 berichtet. In dieser Arbeit wurden sphärische HA-NB-Mikrogele auf einer strömungsfokussierenden mikrofluidischen Plattform für kontrollierte Größe und Form erzeugt, wie zuvor beschrieben 8,9,10. Nach der Reinigung liegen die Mikrogele in einer wässrigen Suspension vor und müssen konzentriert werden, um einen verklemmten Zustand zu induzieren. Wenn sie verklemmt sind, weisen Mikrogele scherverdünnende Eigenschaften auf, die es ihnen ermöglichen, als injizierbare, raumfüllende Materialien zu fungieren1. Eine Methode zur Induktion eines gestauten Zustands besteht darin, die Mikrogele durch Lyophilisation oder Gefriertrocknung zu trocknen und anschließend das getrocknete Produkt in einem kontrollierten Volumen zu rehydrieren12. Alternativ kann überschüssiger Puffer aus der Mikrogelaufschlämmung durch Zentrifugieren über einem Sieb oder durch manuelles Entfernen des Puffers aus dem Mikrogelpellet entweder durch Absaugen oder unter Verwendung eines absorbierenden Materials entfernt werden. Die Verwendung von Zentrifugation zum Trocknen der Mikrogele kann jedoch bei der Herstellung von körnigen Gerüsten12 einen sehr variablen Bereich von Partikelfraktionen und Hohlraumfraktionen erzeugen. Techniken zur Lyophilisierung von Mikrogelen wurden unter Verwendung von 70% IPA für Polyethylenglykol (PEG)-Mikrogele13, fluorierten Ölen für Gelatinemethacryloyl (GelMa)-Mikrogele 14 und 70% Ethanol für HA-Mikrogele12 beschrieben. Dieses Protokoll hebt Methoden zur Gefriertrocknung kugelförmiger HA-Mikrogele unter Verwendung von 70% Ethanol, einem Standardlaborreagenz, hervor, um die ursprünglichen Mikrogeleigenschaften während des Trocknungsprozesses beizubehalten. Die gefriergetrockneten HA-Mikrogele können mit benutzerdefinierten Gewichtsprozentsätzen gewogen und rehydriert werden, um die endgültigen Partikelfraktionen in MAP-Gerüsten12 zu kontrollieren.
Der letzte Schritt bei der MAP-Gerüstbildung beruht auf dem Glühen der Mikrogele, um ein poröses Gerüst zu erzeugen1. Durch die Verwendung nativer extrazellulärer Matrixkomponenten und den Einsatz bioorthogonaler Glühschemata dienen MAP-Gerüste als biokompatible Plattform sowohl für die In-vitro-Zellkultur als auch für die In-vivo-Gewebereparatur 3. Durch diese Ansätze können MAP-Gerüste aus HA-NB-Bausteinen mit benutzerdefinierten Partikelfraktionen für ihren Einsatz in Tissue-Engineering-Anwendungen hergestellt werden12. Das folgende Protokoll beschreibt die mikrofluidische Produktion von HA-NB-Mikrogelen gefolgt von Lyophilisation und Rehydratation zur Kontrolle der Partikelfraktion in MAP-Gerüsten. Schließlich werden Schritte zum Glühen der Mikrogele unter Verwendung bioorthogonaler Chemie für in vitro 3D-Zellkulturexperimente beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mikrofluidische Herstellung von HA-NB-Mikrogelen erzeugt nachweislich Mikrogele mit einem engeren Größenverteilungsbereich als dieEmulsionschargenproduktion 3,9. Die in diesem Protokoll beschriebenen Mikrogele wurden unter Verwendung eines MMP-spaltbaren Vernetzers (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) formuliert, um den Materialabbau zu unterstützen. HA-NB-Mikrogele können jedoch auch mit einem alternativen Dithiol-Linker wie Dithiothreitol (DTT) vernetz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den National Institutes of Health, den National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) und dem National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Diese Arbeit wurde zum Teil an der Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF) durchgeführt, einem Mitglied des North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), das von der National Science Foundation (Preisnummer ECCS-2025064) als Teil der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI) unterstützt wird. Die Autoren danken dem ehemaligen Postdoc des Labors, Dr. Lucas Schirmer, sowie Ethan Nicklow für ihre Unterstützung bei der Erstellung des 3D-gedruckten Geräts für Zellkulturexperimente.
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
- Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
- Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
- JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
- Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
- Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
- Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
- Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).
