현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 생물학에 대한 이해의 놀라운 발전에도 불구하고, 임상 시험에 참여하는 종양학 약물 후보의 대다수는 종종 임상 효능의 부족으로 인해 실패합니다. 이 높은 실패율은 주로 종양 이질성과 종양 미세 환경을 반영하는 데 부적절하기 때문에 현재 전임상 모델이 임상 효능을 예측할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 한계는 개별 환자에서 추출한 인간 종양 샘플에서 확립된 3차원(3D) 배양 모델(스페로이드)로 해결할 수 있습니다. 이러한 3D 배양은 종양 이질성을 반영하지 않는 기존 세포주보다 실제 생물학을 더 잘 나타냅니다. 또한 3D 배양은 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제하고 자연적인 세포 형태 및 성장을 보존하기 때문에 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)보다 우수합니다. 본 연구에서는 3D 및 다세포 스페로이드에서 성장하는 개별 환자로부터 암세포의 1차 배양물을 제조하는 방법을 개발했습니다. 세포는 환자 종양 또는 환자 유래 이종이식으로부터 직접 유래될 수 있다. 이 방법은 고형 종양(예: 결장, 유방 및 폐)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 여기에서는 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사라는 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이러한 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
시험관 내 및 생체 내 연구는 암 치료법 개발을 위한 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 체외 모델은 대부분의 실험 변수를 제어하고 정량적 분석을 용이하게 합니다. 그들은 종종 저비용 스크리닝 플랫폼 역할을 하며 기계론적 연구에도 사용할 수 있습니다1. 그러나, 이들의 생물학적 관련성은 본질적으로 제한적인데, 그러한 모델은 종양 미세환경을 부분적으로만 반영하기 때문이다1. 대조적으로, 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 모델은 종양 미세 환경의 복잡성을 포착하고 환자의 중개 연구 및 개별화 치료(즉, 개별 환자에서 파생된 모델에서 약물에 대한 반응 조사)에 더 적합합니다1. 그러나 생체 내 모델은 실험 매개 변수를 시험관 내 모델만큼 엄격하게 제어 할 수 없으며 개발에 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 약물 스크리닝을위한 고 처리량 접근법에 도움이되지 않습니다 1,2.
시험관 ....
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프로토콜
원발성 종양 세포 배양에 사용된 인간 종양 샘플의 수집은 환자의 서면 동의와 함께 Rabin Medical Center에서 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여할 수 있는 환자는 비전이성 유방암, 결장암, 간암, 폐암, 신경내분비암, 난소암 또는 췌장암, 소아암 또는 전이성 암이 있는 남성 및 여성 성인 및 소아암 환자를 포함했습니다. 유일한 제외 기준은 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있는 능력이 부족하다는 것이었습니다.
1. 스페로이드의 생성 및 수집
참고: 원발성 종양 세포의 분리는 Kodak et al.8에 설명된 대로 수행할 수 있습니다. 중요하게도, 스페로이드를 생성하는데 사용되는 원발성 종양 세포는 생검, 절제 등에 의해 얻어진 환자 샘플로부터 직접 유도될 수 있거나, Moskovits et al.9에 의해 기술된 바와 같이, 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델로부터의 종양 샘플을 사용하여 간접적으로 유래될 수 있다.
- 단일 세포 부착 일차 세포 배양액이 있는 작은 플라스크(T25)....
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결과
이 프로토콜은 원발성 종양 세포에서 스페로이드의 균질한 배양을 생성하고, 스페로이드 배양에 대한 약물 효능을 정량적으로 평가하고(MTT 분석), 스페로이드 형태에 대한 연구 약물의 효과를 결정하는 절차를 제시합니다. 결장암 및 유방암 세포 배양에서 생성된 스페로이드의 대표적인 실험 데이터가 제시됩니다. 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암을 포함한 다른 종양 유형을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다 (데이터는 나타내지 않음). 본원에 제시된 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 2 는 원발성 대장암 세포 배양물로부터 생성된 스페로이드를 나타낸 것이다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 생성되는 스페로이드의 수는 각 웰에 처음 파종된 세포의 수에 따라 달라집니다. 스페로이드가 직경 100μm 이상으로 성장하는 데 10-14일이 걸렸습니다. 종양 세포의 기원 (예를 들어, 상이한 환자 및 .......
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토론
본 프로토콜은 인간 종양 샘플로부터 유래된 3D 일차 세포 배양물(스페로이드)을 생성하기 위한 간단한 방법을 설명한다. 이러한 스페로이드는 잠재적인 약물 후보 및 약물 조합 평가, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적 식별, 반응 및 내성 메커니즘 조사를 포함한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 샘플에서 직접 파생된 원발성 종양 세포 또는 환자 샘플을 사용하여 확립할 수 있는 PDX 모델의 종양 세포를 사용합니다. 후자의 접근법은 동일한 원발성 종양으로 시험관 내 및 생체 내 실험을 수행 할 수 있습니다. PDX 모델과이들 모델에서 파생된 3D 배양 간의 약물 감수성 실험 결과에서 일관성이 이전에 나타났으며9, 따라서 이러한 in vitro/in vivo 접근법의 관련성을 뒷받침한다.
현재 프로토콜의 주요 장점은 대부분의 고형 종양에 대한 광범위한 적용 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| 컬트렉스 | Trevigen | 3632-010-02 | 기저막 매트릭스, 타입 3 |
| DMSO (디메틸 설폭사이드) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA 리더 | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| 염산 (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | 중지 솔루션 |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | 버전 1.52a | 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | 정지 용액 |
| L-글루타민 | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| 비필수 아미노산 | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*칼슘과 마그네슘 |
| 페니실린 없음; 스트렙토마이신 | Invitrogen | 2119399 | |
| 페놀 프리 RPMI 1640 | 생물학 산업, 이스라엘 | 01-103-1A | |
| 피펫 저장소 | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 배양 배지 | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% 용액 | 생물학 산업, 이스라엘 | 03-102-1B | |
| 초저 어태치먼트 96 웰 플레이트 | Greiner Bio-one | 650970 | |
| 비노렐빈 | 에베베 | 11733027-03 | 나벨빈 |
참고문헌
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
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재인쇄 및 허가
