In Silico Identificatie en karakterisering van circRNA's tijdens gastheer-pathogeen interacties

Summary

Het hier ingediende protocol verklaart de volledige in silico-pijplijn die nodig is om circRNA’s te voorspellen en functioneel te karakteriseren uit RNA-sequencing transcriptoomgegevens die gastheer-pathogeeninteracties bestuderen.

Abstract

Circulaire RNA’s (circRNA’s) zijn een klasse van niet-coderende RNA’s die worden gevormd via back-splicing. Deze circRNA’s worden voornamelijk bestudeerd voor hun rol als regulatoren van verschillende biologische processen. Met name opkomend bewijs toont aan dat gastheer circRNA’s differentieel tot expressie kunnen worden gebracht (DE) bij infectie met pathogenen (bijv. Influenza en coronavirussen), wat een rol suggereert voor circRNA’s bij het reguleren van aangeboren immuunresponsen van de gastheer. Onderzoek naar de rol van circRNA’s tijdens pathogene infecties wordt echter beperkt door de kennis en vaardigheden die nodig zijn om de noodzakelijke bioinformatische analyse uit te voeren om DE-circRNA’s te identificeren uit RNA-sequencing (RNA-seq) -gegevens. Bioinformatica voorspelling en identificatie van circRNA’s is cruciaal voor elke verificatie, en functionele studies met behulp van kostbare en tijdrovende wet-lab technieken. Om dit probleem op te lossen, wordt in dit manuscript een stapsgewijs protocol van in silico-voorspelling en karakterisering van circRNA’s met behulp van RNA-seq-gegevens verstrekt. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier stappen: 1) Voorspelling en kwantificering van DE-circRNA’s via de CIRIquant-pijplijn; 2) Annotatie via circBase en karakterisering van DE circRNA’s; 3) CircRNA-miRNA interactie voorspelling via Circr pijplijn; 4) functionele verrijkingsanalyse van circRNA-oudergenen met behulp van Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Deze pijplijn zal nuttig zijn bij het stimuleren van toekomstig in vitro en in vivo onderzoek om de rol van circRNA’s in gastheer-pathogeen interacties verder te ontrafelen.

Introduction

Gastheer-pathogeen interacties vertegenwoordigen een complex samenspel tussen de pathogenen en gastheerorganismen, dat de aangeboren immuunresponsen van de gastheren veroorzaakt die uiteindelijk resulteren in de verwijdering van binnendringende pathogenen ^1,2. Tijdens pathogene infecties wordt een groot aantal immuungenen van de gastheer gereguleerd om de replicatie en afgifte van pathogenen te remmen. Gemeenschappelijke interferon-gestimuleerde genen (ISG’s) gereguleerd op pathogene infecties omvatten bijvoorbeeld ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I en OASL ^3,4. Naast eiwitcoderende genen hebben studies ook gemeld dat niet-coderende RNA’s zoals lange niet-coderende RNA’s (lncRNA’s), microRNA’s (miRNA’s) en circulaire RNA’s (circRNA’s) ook een rol spelen en gelijktijdig worden gereguleerd tijdens pathogene infecties ^5,6,7. In tegenstelling tot eiwitcoderende genen die voornamelijk coderen voor eiwitten als functionele moleculen, is het bekend dat niet-coderende RNA’s (ncRNA’s) functioneren als regulatoren van genen op transcriptionele en post-transcriptionele niveaus. Studies met de deelname van niet-coderende RNA’s, met name circRNA’s, bij het reguleren van de immuungenen van de gastheren zijn echter niet goed gerapporteerd in vergelijking met de eiwitcoderende genen.

CircRNA’s worden op grote schaal gekenmerkt door hun covalent gesloten continue lusstructuur, die wordt gegenereerd door een niet-canoniek splicingproces dat back-splicing⁸ wordt genoemd. Het proces van back-splicing, in tegenstelling tot het splicingproces van verwante lineaire RNA’s, omvat de ligatie van de downstream donorplaats naar de upstream acceptorplaats, waardoor een cirkelvormige structuur wordt gevormd. Momenteel zijn drie verschillende back-splicing mechanismen voor de biogenese van circRNA’s voorgesteld. Dit zijn RNA binding protein (RBP) gemedieerde circularisatie^9,10, intron-pairing-gedreven circularisatie 11 en lariat-gedreven circularisatie^12,13,14. Aangezien circRNA’s end-to-end verbonden zijn in een cirkelvormige structuur, hebben ze de neiging om van nature resistent te zijn tegen normale exonuclease-verteringen en worden ze daarom als stabieler beschouwd dan hun lineaire tegenhangers¹⁵. Een ander gemeenschappelijk kenmerk van circRNA’s omvat de cel- of weefseltypespecifieke expressie in gastheren¹⁶.

Zoals geïmpliceerd door hun unieke structuur en cel- of weefselspecifieke expressie, is ontdekt dat circRNA’s belangrijke biologische functies in cellen spelen. Tot op heden is een van de prominente functies van circRNA’s hun rol als microRNA (miRNA) sponzen^17,18. Deze regulerende rol van circRNA’s vindt plaats door de complementaire binding van circRNA-nucleotiden met het zaadgebied van miRNA’s. Een dergelijke circRNA-miRNA-interactie remt de normale regulerende functies van de miRNA’s op doel-mRNA’s, waardoor de expressie van genen^{wordt gereguleerd 19,20}. Bovendien is ook bekend dat circRNA’s genexpressie reguleren door interactie met RNA-bindende eiwitten (RBP’s) en het vormen van RNA-eiwitcomplexen²¹. Hoewel circRNA’s worden geclassificeerd als niet-coderende RNA’s, zijn er ook aanwijzingen dat circRNA’s kunnen fungeren als sjablonen voor eiwittranslatie^22,23,24.

Onlangs is aangetoond dat circRNA’s een cruciale rol spelen bij het reguleren van de gastheer-pathogeen interacties, met name tussen de gastheren en virussen. Over het algemeen wordt aangenomen dat gastheercircRNA’s helpen bij het reguleren van de immuunresponsen van de gastheer om de binnendringende pathogenen te elimineren. Een voorbeeld van circRNA dat immuunresponsen van de gastheer bevordert, is circRNA_0082633, gerapporteerd door Guo et ^al.25. Dit circRNA verbetert type I interferon (IFN) signalering in A549-cellen, wat helpt om influenzavirusreplicatie^{te onderdrukken 25}. Bovendien rapporteerden Qu et al. ook een humaan intronisch circRNA, circRNA AIVR genaamd, dat de immuniteit bevordert door de expressie van CREB-bindend eiwit (CREBBP), een signaaltransducer van IFN-β^26,27, te reguleren. Er bestaan echter ook circRNA’s waarvan bekend is dat ze de pathogenese van ziekte bij infectie bevorderen. Yu et al. rapporteerden bijvoorbeeld onlangs de rol die een circRNA uit het GATA-zinkvingerdomein met het 2A-gen (circGATAD2A) speelt bij het bevorderen van de replicatie van het H1N1-virus door de remming van autofagie van de gastheercel²⁸.

Om circRNA’s effectief te bestuderen, wordt meestal een genoombreed circRNA-voorspellingsalgoritme geïmplementeerd, gevolgd door een in silico-karakterisering van de voorspelde circRNA-kandidaten voordat functionele studies kunnen worden uitgevoerd. Een dergelijke bioinformatica-benadering om circRNA’s te voorspellen en te karakteriseren is minder kostbaar en tijdsefficiënter. Het helpt om het aantal kandidaten dat functioneel moet worden bestudeerd te verfijnen en kan mogelijk leiden tot nieuwe bevindingen. Hier bieden we een gedetailleerd op bioinformatica gebaseerd protocol voor de in silico-identificatie , karakterisering en functionele annotatie van circRNA’s tijdens de gastheer-pathogeen interacties. Het protocol omvat de identificatie en kwantificering van circRNA’s uit RNA-sequencing datasets, annotatie via circBase en de karakterisering van de circRNA-kandidaten in termen van circRNA-typen, aantal overlappende genen en voorspelde circRNA-miRNA-interacties. Deze studie biedt ook de functionele annotatie van de circRNA-oudergenen via Gene Ontology (GO) en de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyse.

Protocol

In dit protocol werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheek datasets bereid uit de influenza A virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload en gebruikt uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database. De volledige bioinformatica-pijplijn van voorspelling tot functionele karakterisering van circRNA’s is samengevat in figuur 1. Elk deel van de pijplijn wordt verder uitgelegd in de onderstaande secties. 1. Voorber…

Representative Results

Het protocol dat in de vorige sectie is ingeschakeld, is aangepast en geconfigureerd voor het Linux OS-systeem. De belangrijkste reden is dat de meeste modulebibliotheken en pakketten die betrokken zijn bij de analyse van circRNA’s alleen op het Linux-platform kunnen werken. In deze analyse werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheekdatasets bereid uit de influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload uit de GEO-database42 en gebruikt om …

Discussion

Om het nut van dit protocol te illustreren, werd RNA-seq van influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen als voorbeeld gebruikt. CircRNA’s die functioneren als potentiële miRNA-sponzen in gastheer-pathogeen interacties en hun GO- en KEGG-functionele verrijking binnen een gastheer werden onderzocht. Hoewel er verschillende circRNA-tools online beschikbaar zijn, is elk van hen een op zichzelf staand pakket dat niet met elkaar communiceert. Hier hebben we enkele van de tools samengesteld die nodig zijn voor…

Materials

Bedtools	GitHub	https://github.com/arq5x/bedtools2/	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWA	Burrows-Wheeler Aligner	http://bio-bwa.sourceforge.net/	Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Circr	GitHub	https://github.com/bicciatolab/Circr	Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquant	GitHub	https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant	Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs
Clusterprofiler	GitHub	https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler	Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPU	Intel	Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)	Specifications used to run this entire protocol.
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/download.html	Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQC	Babraham Bioinformatics	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2		http://daehwankimlab.github.io/hisat2/	Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Linux	Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)	https://releases.ubuntu.com/focal/	Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRanda		http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtools	pybedtools 0.8.2	https://pypi.org/project/pybedtools/	Needed for BED file genomic manipulation
Python	Python 2.7 and 3.6 or abover	https://www.python.org/downloads/	To run necessary library modules
R	The Comprehensive R Archive Network	https://cran.r-project.org/	To manipulate dataframes
RNAhybrid	BiBiServ	https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudio	RStudio	https://www.rstudio.com/	A workspace to run R
samtools	SAMtools	http://www.htslib.org/	Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTie	Johns Hopkins University: Center for Computational Biology	http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml	Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScan	GitHub	https://github.com/nsoranzo/targetscan	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr