Den protokol, der indsendes her, forklarer den komplette in silico-pipeline , der er nødvendig for at forudsige og funktionelt karakterisere circRNA’er fra RNA-sekventeringstranskriptomdata, der studerer værtspatogeninteraktioner.
Cirkulære RNA’er (circRNA’er) er en klasse af ikke-kodende RNA’er, der dannes via back-splejsning. Disse circRNA’er studeres overvejende for deres roller som regulatorer af forskellige biologiske processer. Især viser nye beviser, at værts-circRNA’er kan udtrykkes forskelligt (DE) ved infektion med patogener (f.eks. Influenza og coronavirus), hvilket tyder på en rolle for circRNA’er i reguleringen af værtsmedfødte immunresponser. Undersøgelser af circRNA’ers rolle under patogene infektioner er imidlertid begrænset af den viden og de færdigheder, der kræves for at udføre den nødvendige bioinformatiske analyse for at identificere DE-circRNA’er fra RNA-sekventeringsdata (RNA-seq). Bioinformatik, forudsigelse og identifikation af circRNA’er er afgørende før enhver verifikation og funktionelle undersøgelser ved hjælp af dyre og tidskrævende vådlaboratorieteknikker. For at løse dette problem findes en trinvis protokol for in silico-forudsigelse og karakterisering af circRNA’er ved hjælp af RNA-seq-data i dette manuskript. Protokollen kan opdeles i fire trin: 1) Forudsigelse og kvantificering af DE-circRNA’er via CIRIquant-pipelinen; 2) Annotation via circBase og karakterisering af DE circRNA’er; 3) CircRNA-miRNA-interaktionsforudsigelse gennem Circr-rørledning; 4) funktionel berigelsesanalyse af circRNA-forældregener ved hjælp af Gene Ontology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Denne pipeline vil være nyttig til at drive fremtidig in vitro – og in vivo-forskning for yderligere at optrævle circRNA’ernes rolle i værtspatogeninteraktioner.
Værtspatogeninteraktioner repræsenterer et komplekst samspil mellem patogenerne og værtsorganismerne, som udløser værternes medfødte immunrespons, der i sidste ende resulterer i fjernelse af invaderende patogener 1,2. Under patogene infektioner reguleres en lang række af værtsimmungenerne for at hæmme replikationen og frigivelsen af patogener. For eksempel omfatter almindelige interferonstimulerede gener (ISG’er), der reguleres af patogene infektioner, ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I og OASL 3,4. Udover proteinkodende gener har undersøgelser også rapporteret, at ikke-kodende RNA’er såsom lange ikke-kodende RNA’er (lncRNA’er), mikroRNA’er (miRNA’er) og cirkulære RNA’er (circRNA’er) også spiller en rolle og reguleres samtidigt under patogene infektioner 5,6,7. I modsætning til proteinkodende gener, der hovedsageligt koder for proteiner som funktionelle molekyler, er ikke-kodende RNA’er (ncRNA’er) kendt for at fungere som regulatorer af gener på transkriptionelle og posttranskriptionelle niveauer. Undersøgelser, der involverer deltagelse af ikke-kodende RNA’er, især circRNA’er, i reguleringen af værternes immungener, er imidlertid ikke godt rapporteret sammenlignet med de proteinkodende gener.
CircRNA’er er bredt karakteriseret ved deres kovalent lukkede kontinuerlige sløjfestruktur, som genereres gennem en ikke-kanonisk splejsningsproces kaldet back-splejsning8. Processen med back-splejsning, i modsætning til splejsningsprocessen af beslægtede lineære RNA’er, involverer ligering af nedstrøms donorstedet til opstrøms acceptorstedet, der danner en cirkulærformet struktur. I øjeblikket er der foreslået tre forskellige back-splejsningsmekanismer til biogenese af circRNA’er. Disse er RNA-bindende protein (RBP) medieret cirkularisering 9,10, intronparringsdrevet cirkularisering 11 og lariatdrevet cirkularisering12,13,14. I betragtning af at circRNA’er er forbundet ende-til-ende i en cirkulær struktur, har de tendens til at være naturligt resistente over for normale eksonukleasefordøjelser og anses derfor for at være mere stabile end deres lineære modstykker15. En anden fælles egenskab, der udvises af circRNA’er, inkluderer det celle- eller vævstypespecifikke udtryk i værter16.
Som antydet af deres unikke struktur og celle- eller vævsspecifikke ekspression er circRNA’er blevet opdaget at spille vigtige biologiske funktioner i celler. Til dato er en af de fremtrædende funktioner i circRNA’er deres rolle som microRNA (miRNA) svampe17,18. Denne regulatoriske rolle af circRNA’er forekommer gennem den komplementære binding af circRNA-nukleotider med frøområdet af miRNA’er. En sådan circRNA-miRNA-interaktion hæmmer miRNA’ernes normale regulatoriske funktioner på mål-mRNA’er og regulerer således ekspressionen af gener 19,20. Derudover er circRNA’er også kendt for at regulere genekspression ved at interagere med RNA-bindende proteiner (RBP’er) og danne RNA-proteinkomplekser21. Selvom circRNA’er er klassificeret som ikke-kodende RNA’er, er der også tegn på, at circRNA’er kan fungere som skabeloner til proteinoversættelse22,23,24.
For nylig har circRNA’er vist sig at spille afgørende roller i reguleringen af værtspatogeninteraktionerne, især mellem værterne og vira. Generelt antages værtscirklRNA’er at hjælpe med at regulere værtsens immunrespons for at eliminere de invaderende patogener. Et eksempel på circRNA, der fremmer værtsimmunresponser, er circRNA_0082633, rapporteret af Guo et al.25. Dette circRNA forbedrer type I interferon (IFN) signalering i A549-celler, hvilket hjælper med at undertrykke influenzavirusreplikation25. Desuden rapporterede Qu et al. også et humant intronisk circRNA, kaldet circRNA AIVR, der fremmer immunitet ved at regulere ekspressionen af CREB-bindende protein (CREBBP), en signaltransducer af IFN-β26,27. Imidlertid findes der også circRNA’er, der vides at fremme patogenesen af sygdom ved infektion. For eksempel rapporterede Yu et al. for nylig den rolle, som et circRNA splejset fra GATA-zinkfingerdomænet indeholdende 2A-genet (circGATAD2A) spiller for at fremme H1N1-virusreplikationen gennem hæmning af værtscelleautofagi28.
For effektivt at studere circRNA’er implementeres normalt en genom-wide circRNA-forudsigelsesalgoritme efterfulgt af en in silico-karakterisering af de forudsagte circRNA-kandidater, før der kan udføres funktionelle undersøgelser. En sådan bioinformatisk tilgang til at forudsige og karakterisere circRNA’er er billigere og mere tidseffektiv. Det hjælper med at forfine antallet af kandidater, der skal undersøges funktionelt, og kan potentielt føre til nye resultater. Her leverer vi en detaljeret bioinformatikbaseret protokol til in silico-identifikation , karakterisering og funktionel annotering af circRNA’er under værtspatogeninteraktionerne. Protokollen inkluderer identifikation og kvantificering af circRNA’er fra RNA-sekventeringsdatasæt, annotation via circBase og karakterisering af circRNA-kandidaterne med hensyn til circRNA-typer, antal overlappende gener og forudsagte circRNA-miRNA-interaktioner. Denne undersøgelse giver også den funktionelle annotering af circRNA-forældregenerne gennem genontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) berigelsesanalyse.
For at illustrere nytten af denne protokol blev RNA-seq fra influenza A-virusinficerede humane makrofagceller brugt som et eksempel. CircRNA’er, der fungerer som potentielle miRNA-svampe i værtspatogeninteraktioner, og deres GO- og KEGG-funktionelle berigelse inden for en vært blev undersøgt. Selvom der er en række circRNA-værktøjer tilgængelige online, er hver af dem en selvstændig pakke, der ikke interagerer med hinanden. Her sammensætter vi nogle af de værktøjer, der kræves til circRNA-forudsigelse og kvan…
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren vil gerne takke Tan Ke En og Dr. Cameron Bracken for deres kritiske gennemgang af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fundamental Research Grant Scheme (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) og University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).
Bedtools | GitHub | https://github.com/arq5x/bedtools2/ | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr. |
BWA | Burrows-Wheeler Aligner | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome |
Circr | GitHub | https://github.com/bicciatolab/Circr | Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites |
CIRIquant | GitHub | https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant | Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs |
Clusterprofiler | GitHub | https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler | Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment |
CPU | Intel | Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) | Specifications used to run this entire protocol. |
Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/download.html | Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network |
FastQC | Babraham Bioinformatics | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files |
HISAT2 | http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome | |
Linux | Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) | https://releases.ubuntu.com/focal/ | Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol. |
miRanda | http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr | |
Pybedtools | pybedtools 0.8.2 | https://pypi.org/project/pybedtools/ | Needed for BED file genomic manipulation |
Python | Python 2.7 and 3.6 or abover | https://www.python.org/downloads/ | To run necessary library modules |
R | The Comprehensive R Archive Network | https://cran.r-project.org/ | To manipulate dataframes |
RNAhybrid | BiBiServ | https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |
RStudio | RStudio | https://www.rstudio.com/ | A workspace to run R |
samtools | SAMtools | http://www.htslib.org/ | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
StringTie | Johns Hopkins University: Center for Computational Biology | http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
TargetScan | GitHub | https://github.com/nsoranzo/targetscan | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |