I Silico Identifisering og karakterisering av circRNA under vertspatogeninteraksjoner

Summary

Protokollen som er sendt inn her, forklarer den komplette silico-rørledningen som trengs for å forutsi og funksjonelt karakterisere circRNA fra RNA-sekvenseringstranskriptomdata som studerer vertspatogeninteraksjoner.

Abstract

Sirkulære RNA (circRNAer) er en klasse av ikke-kodende RNA som dannes via back-spleising. Disse sirkRNAene studeres hovedsakelig for deres roller som regulatorer av ulike biologiske prosesser. Spesielt viser nye bevis at vertscircRNA kan uttrykkes differensielt (DE) ved infeksjon med patogener (f.eks. Influensa og koronavirus), noe som tyder på en rolle for circRNA i regulering av vertens medfødte immunresponser. Imidlertid er undersøkelser av rollen til circRNA under patogene infeksjoner begrenset av kunnskapen og ferdighetene som kreves for å utføre den nødvendige bioinformatiske analysen for å identifisere DE-circRNA fra RNA-sekvensering (RNA-seq) data. Bioinformatikk prediksjon og identifisering av circRNA er avgjørende før verifisering, og funksjonelle studier ved hjelp av kostbare og tidkrevende våtlaboratorieteknikker. For å løse dette problemet er det gitt en trinnvis protokoll for in silico-prediksjon og karakterisering av circRNA ved bruk av RNA-seq-data i dette manuskriptet. Protokollen kan deles inn i fire trinn: 1) Prediksjon og kvantifisering av DE circRNA via CIRIquant-rørledningen; 2) Annotering via circBase og karakterisering av DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA-interaksjonsprediksjon gjennom Circr-rørledning; 4) funksjonell berikelsesanalyse av circRNA-foreldregener ved bruk av genontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Denne rørledningen vil være nyttig for å drive fremtidig in vitro og in vivo forskning for ytterligere å avdekke rollen til circRNA i vert-patogen-interaksjoner.

Introduction

Vertspatogeninteraksjoner representerer et komplekst samspill mellom patogener og vertsorganismer, noe som utløser vertenes medfødte immunresponser som til slutt resulterer i fjerning av invaderende patogener ^1,2. Under patogene infeksjoner reguleres en rekke vertsimmungener for å hemme replikasjon og frigjøring av patogener. For eksempel inkluderer vanlige interferonstimulerte gener (ISG) regulert ved patogene infeksjoner ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I og OASL ^3,4. Foruten proteinkodende gener har studier også rapportert at ikke-kodende RNA som lange ikke-kodende RNA (lncRNA), mikroRNA (miRNA) og sirkulære RNA (sircRNA) også spiller en rolle og reguleres samtidig under patogene infeksjoner ^5,6,7. I motsetning til proteinkodende gener som hovedsakelig koder for proteiner som funksjonelle molekyler, er ikke-kodende RNA (ncRNA) kjent for å fungere som regulatorer av gener på transkripsjonelle og posttranskripsjonelle nivåer. Imidlertid er studier som involverer deltakelse av ikke-kodende RNAer, spesielt sircRNAer, i regulering av vertenes immungener, ikke godt rapportert sammenlignet med proteinkodende gener.

CircRNA er bredt preget av deres kovalent lukkede kontinuerlige sløyfestruktur, som genereres gjennom en ikke-kanonisk skjøteprosess kalt back-splicing⁸. Prosessen med tilbakeskjøting, i motsetning til skjøteprosessen av kognitive lineære RNAer, involverer ligering av nedstrøms donorsted til oppstrøms akseptorsted, og danner en sirkulær formet struktur. For tiden er det foreslått tre forskjellige tilbakeskjøtingsmekanismer for biogenese av circRNA. Disse er RNA-bindende protein (RBP) mediert sirkularisering 9,10, intron-paringsdrevet sirkularisering 11 og lariatdrevet sirkularisering^12,13,14. Gitt at sirkRNA er koblet ende-til-ende i en sirkulær struktur, har de en tendens til å være naturlig resistente mot normale eksonuklease fordøyelser og anses dermed å være mer stabile enn deres lineære kolleger¹⁵. En annen vanlig egenskap utstilt av circRNA inkluderer celle- eller vevstypespesifikt uttrykk i verter¹⁶.

Som antydet av deres unike struktur og celle- eller vevsspesifikke uttrykk, har circRNA blitt oppdaget å spille viktige biologiske funksjoner i celler. Til dags dato er en av de fremtredende funksjonene til circRNA deres rolle som mikroRNA (miRNA) svamper^17,18. Denne regulatoriske rollen til circRNA skjer gjennom komplementær binding av circRNA-nukleotider med frøområdet av miRNAer. En slik circRNA-miRNA-interaksjon hemmer miRNAenes normale regulatoriske funksjoner på mål-mRNAer, og regulerer dermed ekspresjonen av gener ^19,20. I tillegg er circRNA også kjent for å regulere genuttrykk ved å interagere med RNA-bindende proteiner (RBP) og danne RNA-proteinkomplekser²¹. Selv om circRNA er klassifisert som ikke-kodende RNA, er det også bevis på at circRNA kan fungere som maler for proteinoversettelse^22,23,24.

Nylig har circRNA vist seg å spille sentrale roller i reguleringen av vertspatogeninteraksjonene, spesielt mellom vertene og virusene. Generelt antas vertscircRNA å hjelpe til med å regulere vertens immunresponser for å eliminere de invaderende patogenene. Et eksempel på circRNA som fremmer vertsimmunresponser er circRNA_0082633, rapportert av Guo et ^al.25. Dette circRNA forbedrer type I interferon (IFN) signalering i A549-celler, noe som bidrar til å undertrykke influensavirusreplikasjon²⁵. Videre rapporterte Qu et al. også et humant intronisk circRNA, kalt circRNA AIVR, som fremmer immunitet ved å regulere ekspresjonen av CREB-bindende protein (CREBBP), en signaltransduser av IFN-β^26,27. Imidlertid finnes det også circRNA som er kjent for å fremme patogenesen av sykdom ved infeksjon. For eksempel rapporterte Yu et al. nylig rollen spilt av et circRNA spleiset fra GATA sinkfingerdomenet som inneholder 2A-genet (circGATAD2A) for å fremme H1N1-virusreplikasjonen gjennom inhibering av vertscelleautofagi²⁸.

For å effektivt studere circRNAer, implementeres vanligvis en genom-bred circRNA-prediksjonsalgoritme, etterfulgt av en in silico-karakterisering av de forutsagte circRNA-kandidatene før noen funksjonelle studier kan utføres. En slik bioinformatisk tilnærming til å forutsi og karakterisere sircRNA er mindre kostbar og mer tidseffektiv. Det bidrar til å avgrense antall kandidater som skal studeres funksjonelt og kan potensielt føre til nye funn. Her gir vi en detaljert bioinformatikkbasert protokoll for in silico identifikasjon, karakterisering og funksjonell annotasjon av circRNA under vertspatogeninteraksjonene. Protokollen inkluderer identifisering og kvantifisering av circRNA fra RNA-sekvenseringsdatasett, annotering via circBase og karakterisering av circRNA-kandidatene når det gjelder circRNA-typer, antall overlappende gener og forventede circRNA-miRNA-interaksjoner. Denne studien gir også funksjonell annotasjon av circRNA-foreldregenene gjennom genontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) anrikningsanalyse.

Protocol

I denne protokollen ble avidentifiserte ribosomale RNA (rRNA)-utarmede RNA-seq-bibliotekdatasett fremstilt fra influensa A-virusinfiserte humane makrofagceller lastet ned og brukt fra databasen Gene Expression Omnibus (GEO). Hele bioinformatikkrørledningen fra prediksjon til funksjonell karakterisering av circRNA er oppsummert i figur 1. Hver del av rørledningen er nærmere forklart i avsnittene nedenfor. 1. Forberedelse, nedlasting og oppsett før dataana…

Representative Results

Protokollen vervet i forrige avsnitt ble endret og konfigurert for å passe Linux OS-systemet. Hovedårsaken er at de fleste modulbiblioteker og pakker som er involvert i analysen av circRNAer, bare kan fungere på Linux-plattformen. I denne analysen ble avidentifiserte ribosomale RNA (rRNA)-utarmede RNA-seq-bibliotekdatasett fremstilt fra influensa A-virusinfiserte humane makrofagceller lastet ned fra GEO-databasen42 og brukt til å generere de representative resultatene. <p class="jove_conte…

Discussion

For å illustrere nytten av denne protokollen ble RNA-seq fra influensa A-virusinfiserte humane makrofagceller brukt som eksempel. CircRNA som fungerer som potensielle miRNA-svamper i vertspatogen-interaksjoner og deres GO og KEGG funksjonelle berikelse i en vert ble undersøkt. Selv om det finnes en rekke circRNA-verktøy tilgjengelig online, er hver av dem en frittstående pakke som ikke samhandler med hverandre. Her setter vi sammen noen av verktøyene som kreves for sircRNA-prediksjon og kvantifisering, circRNA-funks…

Materials

Bedtools	GitHub	https://github.com/arq5x/bedtools2/	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWA	Burrows-Wheeler Aligner	http://bio-bwa.sourceforge.net/	Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Circr	GitHub	https://github.com/bicciatolab/Circr	Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquant	GitHub	https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant	Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs
Clusterprofiler	GitHub	https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler	Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPU	Intel	Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)	Specifications used to run this entire protocol.
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/download.html	Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQC	Babraham Bioinformatics	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2		http://daehwankimlab.github.io/hisat2/	Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Linux	Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)	https://releases.ubuntu.com/focal/	Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRanda		http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtools	pybedtools 0.8.2	https://pypi.org/project/pybedtools/	Needed for BED file genomic manipulation
Python	Python 2.7 and 3.6 or abover	https://www.python.org/downloads/	To run necessary library modules
R	The Comprehensive R Archive Network	https://cran.r-project.org/	To manipulate dataframes
RNAhybrid	BiBiServ	https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudio	RStudio	https://www.rstudio.com/	A workspace to run R
samtools	SAMtools	http://www.htslib.org/	Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTie	Johns Hopkins University: Center for Computational Biology	http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml	Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScan	GitHub	https://github.com/nsoranzo/targetscan	Referring to section 4.1.2. Needed for Circr