使用微泡从人外周血单核细胞样品中分离、活化和扩增基于浮选的 T 细胞
Summary
本研究的目的是证明基于浮选的分离在分离、激活和扩增原代人T细胞方面的可行性。
Abstract
从外周血单核细胞 （PBMC） 中分离 T 细胞以建立 离体 培养的过程对于研究、临床试验和基于细胞的治疗至关重要。在这项研究中，提出了一种简单、新颖的方案，用于 离体从 PBMC中分离、激活和扩增T细胞。本研究利用功能化的浮力激活细胞分选（BACS）技术来分离和活化T细胞。简而言之，该方案涉及从白细胞衍生的PBMC中正向选择CD3 + 细胞，然后在24孔板中转导之前与预缀合的抗CD28结合链霉亲和素微泡（SAMB）共刺激48小时。功能化的微气泡提供了浮力激活细胞的独特机会，导致增殖表型，允许以最小的消耗进行扩增。该技术减少了疲惫，因为共刺激微泡保持浮力并返回培养基的顶部，从而减少了扩增细胞与共刺激因子接触的时间。结果表明，分离和培养的T细胞接受足够的刺激来激活和增殖，但未达到导致过度激活的程度，从而导致耗尽，如过量PD-1的存在所证明的那样。
Introduction
目前全球正在进行500多项嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗临床试验，市场上有四种CAR-T细胞治疗产品1。然而，仍然存在许多CAR-T细胞研究和制造需求，必须解决这些需求，以提高这些潜在疗效疗法的疗效，可扩展性和长期成功2，3，4，5。过继CAR-T细胞临床研究和制造始于从外周血样本中分离T细胞以及随后对分离细胞的刺激，转导和扩增。在为CAR-T细胞研究和制造选择细胞分离和刺激技术时，需要仔细考虑T细胞回收率，纯度和活化/耗竭信号等参数3，4，6。重要的是，需要通过最大限度地减少当前制造过程产生的生物障碍（例如T细胞耗竭）来提高CAR-T细胞疗法的治疗持久性，以提高治疗效果6，7。
作为荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）等传统细胞分离方法的替代方案，这里展示了带有微气泡的浮力激活细胞分选（BACS）用于T细胞分离。微气泡分离使用浮力、空心微球（微气泡）结合目标并将其漂浮到流体样品的表面8，9。通过用抗体（即抗CD3）功能化微泡，可以从外周血样本中积极选择所需的T细胞群。随后，在这项工作中证明了使用不同抗体功能化微泡群（即抗CD28）来共刺激和激活悬浮液中的阳性选择T细胞。微气泡提供了一种简单且高度可调的分离和活化工作流程，可产生可用于悬浮细胞培养和下游应用（如基因修饰和扩增）的 T 细胞。至关重要的是，微气泡的浮力细胞活化可促进抑制细胞刺激，以防止过度的T细胞衰竭7。
在这项研究中，流式细胞术是用于分析功能化微泡的分离、活化和转导成功的主要工具，以及提供有关转导后生长和扩增阶段存在的特定亚群的详细信息。除流式细胞术外，还使用明场和荧光显微镜来确认细胞健康、形态和转导成功。基于这些结果，微气泡技术和方案为目前使用的传统分离和活化方法提供了一种更可调和更温和的替代方案;特别是，微泡激活细胞的T细胞耗竭标志物的表达明显低于行业标准工具和试剂盒通常观察到的表达。
Protocol
Representative Results
Discussion
所述协议允许从PBMC样品中分离T细胞，并用微气泡激活培养基中的悬浮T细胞。该方法依赖于功能化的微气泡，其固有的浮力提供了向细胞引入共刺激信号并在它们悬浮在培养基中时激活它们的独特机会，从而减少膨胀细胞暴露于长时间刺激;这种过度刺激可导致T细胞耗竭标志物的表达增加和治疗效果降低11。浮力附着在功能化微气泡上的受刺激T细胞产生未触及的子细胞，这些子?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
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