Flotationsbasierte T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Expansion aus mononukleären Blutproben des menschlichen peripheren Blutes unter Verwendung von Mikrobläschen
Summary
Ziel dieser Studie ist es, die Machbarkeit einer flotationsbasierten Trennung zur Isolierung, Aktivierung und Erweiterung primärer humaner T-Zellen zu demonstrieren.
Abstract
Der Prozess der Isolierung von T-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zur Etablierung von Ex-vivo-Kulturen ist für Forschung, klinische Tests und zellbasierte Therapien von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie wird ein einfaches, neuartiges Protokoll zur Isolierung, Aktivierung und Expansion von T-Zellen aus PBMCs ex vivo vorgestellt. Diese Studie verwendet die funktionalisierte Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) -Technologie, um T-Zellen zu isolieren und zu aktivieren. Kurz gesagt, beinhaltet das Protokoll die positive Selektion von CD3 + -Zellen aus Leukopak-abgeleiteten PBMCs, gefolgt von einer 48-stündigen Kostimulation mit präkonjugierten Anti-CD28-gebundenen Streptavidin-Mikrobläschen (SAMBs) vor der Transduktion in 24-Well-Platten. Funktionalisierte Mikrobläschen bieten eine einzigartige Möglichkeit, Zellen schwimmfähig zu aktivieren, was zu proliferativen Phänotypen führt, die eine Expansion mit minimaler Erschöpfung ermöglichen. Diese Technik bietet eine reduzierte Erschöpfung, da die co-stimulatorischen Mikrobläschen schwimmfähig bleiben und an die Spitze des Kulturmediums zurückkehren, wodurch die Zeit, in der die expandierenden Zellen mit den kostimulierenden Faktoren in Kontakt sind, verkürzt wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die isolierten und kultivierten T-Zellen genügend Stimulation erhalten, um sich zu aktivieren und zu vermehren, aber nicht in einem Ausmaß, das zu einer Überaktivierung führt, die dann zu Erschöpfung führt, wie das Vorhandensein von übermäßigem PD-1 zeigt.
Introduction
Weltweit werden derzeit mehr als 500 klinische Studien zur chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie durchgeführt, und vier CAR-T-Zelltherapieprodukte sind auf dem Markt erhältlich1. Es bestehen jedoch noch zahlreiche Forschungs- und Herstellungsbedürfnisse für CAR-T-Zellen, die angegangen werden müssen, um die Wirksamkeit, Skalierbarkeit und den langfristigen Erfolg dieser potenziell kurativen Therapien zu verbessern 2,3,4,5. Die klinische Forschung und Herstellung von adoptiven CAR-T-Zellen beginnt mit der Isolierung von T-Zellen aus einer peripheren Blutprobe und der anschließenden Stimulation, Transduktion und Expansion der isolierten Zellen. Parameter wie T-Zell-Regeneration, Reinheit und Aktivierungs-/Erschöpfungssignale erfordern eine sorgfältige Berücksichtigung bei der Auswahl der Zellisolierungs- und Stimulationstechniken für die CAR-T-Zellforschung und -herstellung 3,4,6. Wichtig ist, dass die Verbesserung der therapeutischen Persistenz von CAR-T-Zelltherapien durch Minimierung der biologischen Hindernisse, die sich aus den aktuellen Herstellungsprozessen ergeben, wie z.B. die T-Zell-Erschöpfung, erforderlich ist, um die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen 6,7.
Als Alternative zu herkömmlichen Zellisolierungsmethoden wie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) wird hier die Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) mit Mikrobläschen zur T-Zell-Isolierung demonstriert. Die Mikroblasentrennung verwendet schwimmfähige, hohle Mikrokugeln (Mikrobläschen), um die Ziele zu binden und sie an die Oberfläche von Flüssigkeitsproben zu treiben 8,9. Durch die Funktionalisierung von Mikrobläschen mit Antikörpern (d.h. Anti-CD3) können die gewünschten T-Zellpopulationen positiv aus peripheren Blutproben selektiert werden. Anschließend wird in dieser Arbeit die Verwendung einer anderen Population von Antikörper-funktionalisierten Mikrobläschen (d.h. Anti-CD28) zur Co-Stimulation und Aktivierung positiv ausgewählter T-Zellen in Suspension demonstriert. Mikrobläschen bieten einen einfachen und hochgradig abstimmbaren Isolations- und Aktivierungs-Workflow, der T-Zellen erzeugt, die für suspendierte Zellkulturen und nachgelagerte Anwendungen wie genetische Modifikation und Expansion bereit sind. Entscheidend ist, dass die Aktivierung von Auftriebszellen mit Mikrobläschen eine gehemmte Zellstimulation fördert, um eine übermäßige Erschöpfung der T-Zellen zu verhindern7.
Für diese Studie war die Durchflusszytometrie das primäre Werkzeug, um den Isolierungs-, Aktivierungs- und Transduktionserfolg der funktionalisierten Mikrobläschen zu analysieren und detaillierte Informationen über die spezifischen Subpopulationen zu liefern, die während der Wachstums- und Expansionsphasen nach der Transduktion vorhanden waren. Neben der Durchflusszytometrie wurden Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Zellgesundheit, Morphologie und den Transduktionserfolg zu bestätigen. Basierend auf diesen Ergebnissen bieten die Mikroblasentechnologie und das Mikroblasenprotokoll eine abstimmbarere und schonendere Alternative zu den derzeit verwendeten traditionellen Isolations- und Aktivierungsmethoden. Insbesondere zeigen mikroblasenaktivierte Zellen eine deutlich geringere Expression von T-Zell-Erschöpfungsmarkern als die, die typischerweise mit branchenüblichen Werkzeugen und Kits beobachtet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von T-Zellen aus PBMC-Proben und die Aktivierung suspendierter T-Zellen in Kulturmedien mit Mikrobläschen. Diese Methode beruht auf funktionalisierten Mikrobläschen, deren inhärenter Auftrieb eine einzigartige Gelegenheit bietet, ko-stimulatorische Signale in Zellen einzuführen und sie zu aktivieren, während sie in einem Kulturmedium suspendiert sind, wodurch die Exposition der expandierenden Zellen gegenüber längerer Stimulation reduziert wird. Eine solche Üb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
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