이 연구의 목적은 일차 인간 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 부유 기반 분리의 타당성을 입증하는 것입니다.
Abstract
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T 세포를 분리하여 생체 외 배양을 확립하는 과정은 연구, 임상 테스트 및 세포 기반 치료에 매우 중요합니다. 이 연구에서, 생체외 PBMCs로부터 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 간단하고 신규한 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 기능화 된 부력 활성화 세포 분류 (BACS) 기술을 활용하여 T 세포를 분리하고 활성화합니다. 간단히 말해서, 이 프로토콜은 백혈구 유래 PBMC에서 CD3+ 세포의 양성 선택을 포함하고, 24웰 플레이트에서 형질도입하기 전에 사전 접합된 항-CD28 결합 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 사용한 48시간 공동 자극을 포함합니다. 기능화된 마이크로버블은 세포를 부력적으로 활성화할 수 있는 독특한 기회를 제공하여 최소한의 피로로 확장을 허용하는 증식성 표현형을 유도합니다. 이 기술은 공동 자극 마이크로 버블이 부력을 유지하고 배양 배지의 상단으로 돌아가기 때문에 피로를 줄여 팽창 세포가 공동 자극 인자와 접촉하는 시간을 줄입니다. 상기 결과는 단리되고 배양된 T 세포가 활성화 및 증식하기에 충분한 자극을 받지만 과도한 PD-1의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 과잉활성화로 이어지는 과활성화로 이어지는 정도는 아님을 나타낸다.
Introduction
현재 전 세계적으로 500개 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료 임상 시험이 진행 중이며 4개의 CAR-T 세포 치료제품이 시판되고 있습니다1. 그러나, 이러한 잠재적 치유 요법 2,3,4,5의 효능, 확장성 및 장기적인 성공을 개선하기 위해 해결되어야 하는 수많은 CAR-T 세포 연구 및 제조 요구가 여전히 존재한다. 입양 CAR-T 세포 임상 연구 및 제조는 말초 혈액 샘플로부터 T 세포를 분리하고 분리된 세포의 후속 자극, 형질도입 및 확장으로 시작됩니다. T 세포 회수, 순도 및 활성화/고갈 신호와 같은 파라미터는 CAR-T 세포 연구 및 제조3,4,6을 위한 세포 분리 및 자극 기술을 선택할 때 신중한 고려가 필요합니다. 중요하게도, 치료 효능을 향상시키기 위해서는 T 세포 고갈과 같은 현재 제조 공정으로부터 발생하는 생물학적 장애를 최소화함으로써 CAR-T 세포 요법의 치료 지속성을 개선할 필요가 있다6,7.
형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)와 같은 기존 세포 분리 방법의 대안으로 여기에서 T 세포 분리를 위한 마이크로버블을 사용한 부력 활성화 세포 분류(BACS)가 시연됩니다. 마이크로버블 분리는 부력, 중공 마이크로스피어(마이크로버블)를 사용하여 타겟을 결합하고 유체 샘플(8,9)의 표면에 부유시킨다. 마이크로버블을 항체 (즉, 항-CD3)로 기능화함으로써, 목적하는 T 세포 집단을 말초 혈액 샘플로부터 양성으로 선택할 수 있다. 이어서, 현탁액에서 양성으로 선택된 T 세포를 공동-자극하고 활성화시키기 위한 항체-작용화된 마이크로버블 (즉, 항-CD28)의 상이한 집단의 사용이 본 연구에서 입증된다. 마이크로버블은 단순하고 고도로 조정 가능한 분리 및 활성화 워크플로우를 제공하여 부유 세포 배양 및 유전자 변형 및 확장과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 T 세포를 생성합니다. 비판적으로, 마이크로버블을 이용한 부력 세포 활성화는 억제된 세포 자극을 촉진하여 과도한 T 세포 고갈을 방지합니다7.
이 연구에서 유세포 분석은 기능화 된 마이크로 버블의 분리, 활성화 및 형질 도입 성공을 분석하고 형질 도입 후 성장 및 확장 단계에서 존재하는 특정 하위 집단에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 사용되는 주요 도구였습니다. 유세포분석 외에도 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 세포 건강, 형태 및 형질도입 성공을 확인했습니다. 이러한 결과를 바탕으로 마이크로버블 기술 및 프로토콜은 현재 사용되는 기존의 분리 및 활성화 방법에 대한 보다 조정 가능하고 부드러운 대안을 제공합니다. 특히, 마이크로버블-활성화된 세포는 산업 표준 도구 및 키트에서 전형적으로 관찰되는 것보다 T 세포 고갈 마커의 발현이 현저히 낮게 나타난다.
Protocol
1. 양성 선택을 이용한 마이크로버블로 T 세포 분리 참고: 이 프로토콜은 SAMB를 사용하는 소규모 CD3+ 양성 선택 접근 방식을 자세히 설명합니다. 100만 세포당 항체 25ng(25ng/M) 농도의 비오틴화 항-CD3(OKT3) 항체와 함께 2.5mL의 분리 완충액에 3 x 10 8개의 상업적으로 입수한PBMC 를 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분…
Representative Results
T 세포를 구입한 PBMC로부터 단리하고, 프로토콜에 기재된 바와 같이 활성화를 위해 도말하였다. 음성 대조군 샘플 (구입 한 PBMCs)은 활성화되지 않았습니다. 이들 대조군 샘플은 마이크로버블 활성화 과정이 비접촉 및 자극되지 않은 T 세포 대조군과 비교하여 실험 샘플에 미치는 영향을 입증하기 위해 포함되었으며, 관찰된 활성화 마커는 추가된 활성화 인자의 결과이며 T 세포 자체에 내재되지 않…
Discussion
기술된 프로토콜은 PBMC 샘플로부터 T 세포의 단리 및 마이크로버블을 갖는 배양 배지 내의 부유 T 세포의 활성화를 허용한다. 이 방법은 고유 한 부력이 세포에 공동 자극 신호를 도입하고 배양 배지에 현탁되어있는 동안 활성화하여 확장 된 세포의 장기간 자극에 대한 노출을 줄이는 독특한 기회를 제공하는 기능화 된 마이크로 버블에 의존합니다. 이러한 과잉 자극은 T 세포 고갈 마커의 발현 증?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
2-Mercaptoethanol
Gibco
21985-023
CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates
VWR
76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody
Biolegend
302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody
Biolegend
317320
DPBS, no calcium, no magnesium
Gibco
14190-136
GlutaMAX Supplement
Thermofisher
35050061
Human Recombinant IL2
BioVision (vwr)
10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9
Takara Bio
0038VCT
Leukopak
BioIVT
HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs
BioIVT
HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture
VWR
97063-708
CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent
Millipore Sigma
TR-1003-G
CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).