Denne protokol præsenterer en robust, detaljeret metode til at opnå meget rene synaptosomer, synaptiske vesikler og andre synaptiske fraktioner fra musehjernen. Denne metode muliggør evaluering af synaptiske processer, herunder biokemisk analyse af proteinlokalisering og funktion med rumopløsning.
Synaptiske terminaler er de primære steder for neuronal kommunikation. Synaptisk dysfunktion er et kendetegn for mange neuropsykiatriske og neurologiske lidelser. Karakteriseringen af synaptiske underrum ved biokemisk isolering er derfor en kraftfuld metode til at belyse de molekylære baser af synaptiske processer, både i sundhed og sygdom. Denne protokol beskriver isoleringen af synaptiske terminaler og synaptiske underrum fra musehjerner ved subcellulær fraktionering. For det første isoleres forseglede synaptiske terminalstrukturer, kendt som synaptosomer, efter homogenisering af hjernevæv. Synaptosomer er neuronale præ- og postsynaptiske rum med klemte og forseglede membraner. Disse strukturer bevarer en metabolisk aktiv tilstand og er værdifulde til at studere synaptisk struktur og funktion. Synaptosomerne udsættes derefter for hypotonisk lysis og ultracentrifugering for at opnå synaptiske underrum beriget til synaptiske vesikler, synaptisk cytosol og synaptisk plasmamembran. Brøkrenhed bekræftes ved elektronmikroskopi og biokemisk berigelsesanalyse for proteiner, der er specifikke for subsynaptiske rum. Den præsenterede metode er et ligetil og værdifuldt værktøj til at studere synapsens strukturelle og funktionelle egenskaber og molekylære ætiologi af forskellige hjernesygdomme.
Synapser er de grundlæggende beregningsenheder i hjernen, hvorigennem neuroner kommunikerer og udøver forskellige og udsøgt komplekse funktioner. Synapser er således grundlæggende for hjernens sundhed1; Synaptisk dysfunktion er impliceret som kilde eller resultat af mange lidelser2. Synapser udgøres af præ- og postsynaptiske terminaler, forlængelser af to forskellige neuroner, der er tæt apposed og adskilt af en synaptisk kløft krydset af synaptiske adhæsionsmolekyler. Information strømmer fra det præ- til postsynaptiske rum i form af kemiske budbringere kaldet neurotransmittere1. De molekylære processer, der er involveret i neurotransmission, er aktive forskningsområder 3,4,5. Forståelse af de patogene processer inden for synaptiske terminaler og synapsernes respons på patologi i andre neuronale underrum er afgørende skridt til at løse forstyrrelser i hjernen 1,2. Flere metodiske fremskridt, overvejende anvendt på murinemodeller, har fremmet denne forfølgelse6. Isolering af synaptiske fraktioner ved differentiel centrifugering er en sådan paradigmeskiftende metode, der har muliggjort detaljeret evaluering af synaptiske processer inden for sundhed og sygdom.
Den voksne menneskelige hjerne består af 80-90 milliarder neuroner 7,8. Blandt murinearter indeholder rottehjernen ca. ~ 200 millioner neuroner, mens mus har ~ 70 millioner 9,10. Hver neuron danner tusindvis af specifikke synaptiske forbindelser med et netværk af stærkt polariserede neuroner blandet med gliaceller og tæt vaskulatur. I et så komplekst og heterogent væv var det engang utænkeligt at isolere og studere synapser som et uafhængigt system. I 1960’erne gjorde Victor Whittaker, Catherine Hebb og andre dette muligt ved at isolere intakte synaptiske terminaler ved hjælp af subcellulær fraktionering11,12,13,14. I et forsøg på at isolere synaptiske vesikler (SV’er) homogeniserede de hjerner gennem flydende forskydningskraft i iso-osmotisk (0,32 M) saccharose efterfulgt af ultracentrifugering. De opnåede afbrudte, plasmamembranlukkede, intakte nerveterminaler eller varicositeter, som de kaldte nerveendende partikler (NEP’er)11,13. Da synapsens strukturelle og funktionelle egenskaber blev bevaret i disse strukturer, blev NEP’er senere betegnet “synaptosomer” for kongruens med andre subcellulære organeller13,15. Det er værd at bemærke, at Eduardo de Robertis og kollegers arbejde, der opfandt udtrykket “synaptisk vesikel”, overlappede med Whittaker og kolleger og bidrog til valideringen af “synaptosom” isolation og karakterisering16,17,18.
Synaptosomer er fysiologisk aktive strukturer, der indeholder alle de cellulære og molekylære egenskaber, der kræves til opbevaring, frigivelse og genoptagelse af neurotransmittere13,18. Bevarelsen af vigtige synaptiske egenskaber in vitro og frihed fra ikke-synaptiske komponenter bidrager også til nytten af denne isolationsmetode. Synaptosomer har bidraget enormt til forståelsen af de kemiske og fysiologiske egenskaber ved neurotransmission og bruges nu til at studere synaptiske molekylære processer og deres ændringer i sygdom 19,20,21,22,23. Synaptosomer er også det oprindelige kildemateriale til isolering af synaptiske komponenter såsom SV’er, clathrinbelagte vesikler (CCV’er), synaptisk cytosol, synaptisk plasmamembran, synaptiske mitokondrier, synaptiske adhæsionsmolekyler og andre komponenter af interesse, som kan lette forståelsen af de molekylære mekanismer for synaptisk funktion 18,19,20,24,25,26, 27,28. Disse subsynaptiske komponenter kan opnås ved osmotisk lysis af synaptosomer og saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering15,29. Selvom den oprindelige subcellulære fraktioneringsmetode fra Whittakers forskningsgruppe er kendt for at være effektiv til at isolere kvalitetssynaptosomer og SV’er 13,30, forbedrer nylige optimeringer renheden af de subcellulære fraktioner 22,23,31,32. Denne artikel giver en meget detaljeret og tilgængelig version af en klassisk protokol til subcellulær fraktionering af murinhjernevæv til isolering af synaptosomer, SV’er og andre subsynaptiske komponenter.
I deres skelsættende undersøgelser brugte Whittaker og kolleger fire morfologiske kriterier til at identificere synaptosomer: (1) strukturerne har en forseglet plasmamembran; (2) strukturerne indeholder SV’er, der ligner dem i nerveterminaler og varicositeter in situ i størrelse og antal; 3) strukturerne har en eller flere små mitokondrier og (4) den præsynaptiske membran klæbes ofte til en postsynaptisk komponent11,12,13. Selvom de to første kriterier generelt gælder for enhver isolationsmetode, vil ikke alle resulterende synaptosomer i de seneste protokoller, der er beskrevet i denne artikel, have mitokondrier og vedhæftede postsynaptiske terminaler. Ca. 60% af synaptosomerne vil have mitokondrier, og kun op til 15% anslås at have vedhæftede postsynaptiske terminaler37. Hvis postsynaptiske komponenter er af særlig interesse, er brugen af en isotonisk Krebs-lignende homogeniseringsbuffer og trykfiltrering til berigelse kendt for at give høje koncentrationer af synaptosomer med postsynaptiske terminaler (også kaldet synaptoneurosomer)22,38.
Metoden til at ofre dyret kan påvirke kvaliteten af synaptosomer og synaptiske subfraktioner. Voksne dyr, der ofres ved hjælp af en eutanasi-metode, der ikke kræver anæstesi, vil resultere i den bedste fraktionskvalitet. Endvidere skal hjernerne være frisk dissekeret, ikke frosset og homogeniseret ved hjælp af et 1:10-forhold mellem homogeniseringsbuffer (vægt / volumen) for de mest levedygtige synaptiske fraktioner22. Hjernen har en heterogen population af synapser, der kan differentieres efter den type neurotransmittere, de bærer. Synaptosomdannelse påvirkes generelt ikke af synapsetype eller neurotransmitterindhold13. En undtagelse er mosbegroede fibre i lillehjernen, som vides at blive forstyrret under optimale forhold for at opnå synaptosomer fra resten af hjernen39,40. Således anbefales fjernelse af cerebellum før hjernehomogenisering, hvis udelukkelsen af denne region ikke påvirker det eksperimentelle mål. Hvis interesseret i at isolere synaptosomer af en bestemt neurotransmitterkarakter, kan områder i hjernen, der er beriget for neuroner, der indeholder neurotransmitteren af interesse, først isoleres. Denne tilgang vil imidlertid medføre begrænsninger for det endelige brøkudbytte afhængigt af størrelsen af interesseområdet (dyrenes alder er derfor også en overvejelse). Der er immunokemiske metoder til isolering af neurotransmitterspecifikke synaptosomer, men levedygtigheden og udbyttet vil blive væsentligt kompromitteret22. Hvis det er vigtigt at vurdere synaptosomets metaboliske levedygtighed, kan måling af neurotransmitterfrigivelse 41,42 eller visse enzymatiske assays43 anvendes.
Almindelige forurenende stoffer i synaptosompræparater omfatter mikrosomer, frie mitokondrier, SV’er og neuronale og glialmembraner. Forurening kan reduceres ved at øge antallet af vaske ved P1- og P2-fraktionerne22 og undgå resuspension af den røde mitokondriepellet i efterfølgende trin. I eksperimenter, hvor metabolisk levedygtighed og tid er afgørende, vil det være nyttigtat reducere antallet af vaske og bruge Ficoll- eller Percoll-gradienter over saccharosegradienter 44,45,46. Disse metoder reducerer også forurening betydeligt. Whittakers oprindelige protokol gav SV’er af høj kvalitet. Yderligere optimering af Nagy et al.23, inkluderet i denne metode, producerer SV’er med bemærkelsesværdig homogenitet og renhed uden at gå væsentligt på kompromis med udbytte36. Hvis specifikke SV-undertyper er af interesse, såsom glutamatergiske (VGLUT-1-indeholdende) eller GABAergic (VGAT-1-indeholdende) SV’er, kan immunisolering ved hjælp af specifikke antistoffer udføres47,48. Der findes også alternative metoder til isolering af CCV’er fra synaptosomer, som på grund af differentialdensitet muligvis ikke er til stede ved samme grænseflade som SV’er opnået med denne metode20,49,50.
Samlet set kan den nuværende protokol til isolering af synaptiske komponenter optimeres yderligere for at opnå fraktioner med forbedret homogenitet og levedygtighed baseret på kvaliteten og kvantiteten af kildehjernevævet og de eksperimentelle mål. For yderligere fejlfindingsdetaljer skal man henvise til bogkapitler af Dunkley og Robinson22 og Ganzella et al.36.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke P. Colosi for EM-billedforberedelse. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), det amerikanske forsvarsministerium (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinsons (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) og Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Vi skabte grafiske illustrationer ved hjælp af BioRender.com.
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
Pipette Tips | |||
Serological Pipettes | |||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |